用于检测病毒性出血性败血病病毒的遗传突变的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过使用特异性结合VHSV的非病毒体基因的PNA探针和通过分析PNA探针的熔解图形，来辨别病毒性出血性白血病病毒(VHSV)并鉴定其突变的方法。本方法在以下方面有效：简单、快速和准确地辨别感染性水生生物体疾病的病因病毒的突变，可以检测鱼是否被该病毒感染以及鉴定NV基因的突变。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测病毒性出血性败血病病毒的遗传突变的方法
本专利技术涉及用于检测病毒性出血性败血病(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的方法，并且更具体地涉及与VHSV的特定基因特异性结合的PNA探针，和通过分析PNA探针的熔解图形检测VHSVNV中的突变的方法。
技术介绍
病毒性出血性败血病病毒(VHSV)是一种在鱼中导致病毒性出血性败血病(VHS)的病毒。VHSV感染与以下因素有关，包括鱼的种类、鱼身的大小和水温，并且通过从鱼到鱼的水平传播和从母体到卵的垂直传播来表征。鲑科的鱼感染VHSH而表现出疾病的最佳水温约为8℃，并且韩国比目鱼在20℃～15℃或以下的温度被VHSV感染。韩国比目鱼的VHSH感染主要发生在从秋季至下一年春季的低水温时期，导致渔业工业的巨大损失。据报道，在2001年从冬季至春季的低水温时期VHSV对韩国水产养殖的比目鱼造成损害。从2001年起，在每年相似时期观察到VHSV感染的症状。因此，VHSV感染被归类为一般病毒疾病。影响韩国比目鱼的病毒疾病包括VHSV、牙鲆弹状病毒(HIRRV)、水生双RNA病毒等。在这些病毒疾病中，VHSV对韩国比目鱼造成最大损害。此外，VHS为在水生生命疾病控制法案中提供的一种法定传染病。在由VHSH产生的6个病毒蛋白质中，NV区域是唯一的非结构性蛋白质，其主要分布在比目鱼细胞的细胞质中。一些先前的研究揭示了NV蛋白质作为显示出VHS病理的致病性蛋白质起作用。与此同时，用于突变检测的一般方法包括多种分析技术，其包括测序技术、聚合酶链式反应(PCR)技术和微阵列技术。在现有技术的基因测序方法中，根据基因扩增技术(PCR)的原理，添加dNTP和少量的ddNTP，并且在ddNTP随机结合的同时，聚合具有不同长度的DNA链，和在通过电泳分离DNA链时，根据其长度比对DNA链。然而，现在，使4种不同荧光染料附接于每种ddNTP，并且当ddNTP结合时，可以使用荧光检测器证实每个核苷酸序列的信息。该测序方法具有极高的准确性，但是需要相当大量的时间用于测序，并且外部条件，包括样品的混合和样品的浓度，在结果的分析中起不利作用。特别地，在紧急的情况中，时间的消耗可能是非常重要的变量。例如，在遗传突变频繁发生的RNA病毒的情况下，应该快速预测遗传突变，从而可在早期防止RNA病毒的扩散。然而，现有技术牵涉的问题在于不能快速检测这样的突变。同时，近年来，已经积极地运用不是整个基因核苷酸序列而是位于整个基因核苷酸序列的特定区域或标志物(marker)的分析。特别地，已经开发并使用了能够容易地使用探针检测遗传突变的方法。然而，常规水解探针方法具有技术局限，在于其仅能够检测具有遗传信息的区域或标志物。另外，常规探针方法的技术局限如下。第一，它需要已知关于待构建的核苷酸序列的信息。第二，当构建的探针区域的核苷酸发生改变时，不能证实结果，从而不能得到结果。最后，应该将待检测的基因产物构建成具有小于100bp至200bp的长度，使得它对于先前已知的核苷酸序列进行低覆盖的验证。因此，除了测序系统之外的常规探针方法具有的问题在于，这些方法不分析基因核苷酸序列，而是仅能够对于先前已知的核苷酸序列进行低覆盖验证(存在或不存在区域或标志物)。因此，本专利技术的专利技术人已经做出广泛的努力以有效地检测在水生生物体中引起传染性疾病的病毒性出血性败血病病毒(VHSV)的非病毒体(NV)基因中的突变，并且作为结果，已经发现了当比较具有与其附接的报告基团(reporter)和猝灭基团的探针的熔解模式与样品的熔解模式时，可以以快速和准确的方式确定样品间的核苷酸序列同一性，核苷酸序列突变的存在或不存在和核苷酸序列突变的位置，由此完成本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种通过使用具有与其附接的报告基团和猝灭基团的PNA探针检测病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种用于证实病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的核苷酸序列突变的位置的试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的PNA探针。技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供了一种通过使用具有与其附接的报告基团和猝灭基团的PNA探针确定病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过混合(i)含有病毒性出血性败血病病毒(VHSV)的样品或包含病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因的突变位点的靶核酸和(ii)与包含病毒性出血性败血病病毒(VHSV)NV基因的突变位点的靶核酸的核苷酸序列互补地结合的PNA探针，使所述PNA探针与所述样品杂交；(b)在改变杂交产物的温度的同时，获得杂交产物的熔解温度；(c)在划分杂交产物的熔解温度后分配编码；和(d)在与步骤(a)至(b)相同的条件下，使预期具有突变的样品发生反应，由此获得样品的熔解温度，并且参考步骤(c)的分配的编码对获得的熔解温度进行编码，由此确定病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的类型。本专利技术还提供了一种用于证实病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的核苷酸序列突变的位置的试剂盒，所述试剂盒包含多种PNA探针，其每种具有与其附接的报告基团和/或猝灭基团，与病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因互补地结合，并且具有选自SEQIDNO:1至6的核苷酸序列。附图说明图1显示PNA探针的结构特征。图2是显示根据本专利技术的一个优选实施方案使用肽核酸的杂交步骤和获得熔解曲线步骤的示意图。图3至7是显示用于本专利技术的VHSVNV基因的部分和SNP以及源自它们的肽核酸的核苷酸序列的实例的视图。图8是示例性说明包括在根据本专利技术的VHSVNV基因扩增产物上的肽核酸中的主要核苷酸变异的实例的基因位置视图。图9是示例说明根据本专利技术的扩增VHSVNV基因样品、使PNA探针与扩增产物杂交和升高杂交产物的温度的过程的图。图10显示本专利技术中通过将肽核酸应用于VHSVcDNA样品而获得的扩增曲线的实例。图11显示本专利技术中通过将肽核酸应用于VHSVcDNA样品而获得的温度依赖性熔解曲线的实例。图12显示根据本专利技术的一个优选实施方案，将Tm值转换成条形码的一系列过程。图13显示根据本专利技术的一个优选实施方案，基于条形码检测核苷酸序列突变的一系列过程。图14显示使用根据本专利技术的一个实例产生的条形码获得的VHSV突变的系统发生树。具体实施方案除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所述领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。一般地，以下将描述的本文所使用的命名和实验方法是本领域中公知和通常采用的那些。在本专利技术的一个实施方案中，本专利技术的专利技术人试图在没有测序步骤的情况下，检测VHSV(其为一种导致传染性水生生物体疾病的病毒，如在世界动物卫生组织(OIE)水生动物卫生法典中所列举的)的非病毒体(NV)基因中的核苷酸序列突变。作为结果，使用对VHSV非病毒体(NV)基因具有特异性的核苷酸序列和肽核酸探针(PNA探针)，可以鉴定或检测VHSV非病毒体(NV)基因中的突变。因此，在一方面，本专利技术涉及通过使用具有与其附接的报告基团和猝灭基团的PNA探针确定病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过使用具有与其附接的报告基团和猝灭基团的PNA探针确定病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过混合(i)含有病毒性出血性败血病病毒(VHSV)或包含病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因的突变位点的靶核酸的样品和(ii)与所述包含病毒性出血性败血病病毒(VHSV)NV基因的突变位点的靶核酸的核苷酸序列互补地结合的PNA探针，使每个PNA探针与样品杂交；(b)在改变杂交产物的温度的同时，获得所述杂交产物的熔解温度；(c)将所述杂交产物的每个熔解温度划分为对于每个PNA探针的温度区带，并且将编码分配给所述温度区带；和(d)在与步骤(a)至(b)相同的条件下，使预期具有突变的样品发生反应，由此获得样品的熔解温度，并且根据步骤(c)的分配的编码对获得的熔解温度进行编码，由此确定病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的类型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.15 KR 10-2016-01517651.一种通过使用具有与其附接的报告基团和猝灭基团的PNA探针确定病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过混合(i)含有病毒性出血性败血病病毒(VHSV)或包含病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因的突变位点的靶核酸的样品和(ii)与所述包含病毒性出血性败血病病毒(VHSV)NV基因的突变位点的靶核酸的核苷酸序列互补地结合的PNA探针，使每个PNA探针与样品杂交；(b)在改变杂交产物的温度的同时，获得所述杂交产物的熔解温度；(c)将所述杂交产物的每个熔解温度划分为对于每个PNA探针的温度区带，并且将编码分配给所述温度区带；和(d)在与步骤(a)至(b)相同的条件下，使预期具有突变的样品发生反应，由此获得样品的熔解温度，并且根据步骤(c)的分配的编码对获得的熔解温度进行编码，由此确定病毒性出血性败血病病毒(VHSV)非病毒体(NV)基因中的突变的类型。2.权利要求1的方法，其中，所述PNA探针具有由SEQIDNO:1至6中的任一个表示的序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：黃智妍，赵眉英，权文璥，池宝荣，徐正守，黄晟敦，朴明爱，孙孟铉，
申请(专利权)人：大韩民国国立水产科学院，
类型：发明
国别省市：韩国,KR