用于从生物样品中提取核酸的方法技术

本发明专利技术涉及用于从生物样品中提取核酸的方法，其中所述提取方法提供了用于有效地提取核酸的新方法。当从常规生物样品中提取核酸时，因为存在于生物样品中的多种杂质未被适当地除去，因此纯化率低。然而，根据本发明专利技术，提供了用于从生物样品中提取核酸的方法，其中通过在生物样品破碎步骤和纯化步骤中添加表面活性剂和硫酸钠(Na2SO4)溶液而提高了细菌和核酸的回收率，从而使得能够以更大的灵敏度和准确度检测病原体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从生物样品中提取核酸的方法
本专利技术涉及用于从生物样品中提取核酸的方法，并且更具体地，涉及用于提取核酸的方法，其通过使用生物样品的与现有的用于提取核酸的商业方法不同的方法，通过有效地从复杂环境和生物样品中除去杂质提高了核酸回收率。
技术介绍
最近，已经开发了多种灵敏且准确地检测病原体的方法，例如选择性培养基方法、使用特异性抗体或抗原的特异性反应方法、或核酸扩增方法。通过使用几种生物或化学材料(例如纳米颗粒、酶、化学发光试剂或脂质体)引入检测信号的放大，已经快速发展了上述方法的检测限，并且在它们当中，有几种方法已经被商业化。然而，由于样品预处理过程(浓缩和纯化)持续需要长的时间段，因此信号放大方法的开发和检测时间的缩短仍然是样品中病原体检测方法中的重要开发任务。由于样品的组分复杂，因此难以在没有预处理过程的情况下进行生物检测方法，例如使用抗体或酶促反应的测定，此外，难以将浓缩过程应用于不能培养的目标，例如诺如病毒。饮用水和简单的食物样品例如水果和蔬菜中固有的病原体的物理、化学或生物浓缩方法已经得到了不同的开发，例如离心法、使用聚乙二醇(PEG)的沉积法、使用带电过滤器的浓缩法、通过使用NaCl增加离子强度的吸附法、使用二价阳离子(Ca2+和Mg2+)的浓缩法、以及使用抗体的分离方法。然而，为了在现场快速且有成效地检测细菌或病毒，仍存在缩短预处理时间和提高在低浓度下的检测效率两个重要问题。因此，从科学或商业角度来看，一直需要简单地浓缩和破坏病原体的方法。当生物样品是粪便时，作为现有的商业化方法，在分离粪便样品的过程期间经常使用用于使粪便沉淀并从粪便中分离核酸的方法。例如，MoBioLaboratoriesInc.(Carlsbad，美国)提出了一种通过使用三价阳离子(例如铝)使杂质絮凝的方法，并且通过使用Boom技术(Boomtechnology)浓缩/纯化DNA的一个重要特征在于通过使用Al3+和NH43+等来使杂质沉淀的方法，该方法对于复杂样品(例如粪便或土壤)非常有效并且在现有的技术中显示出最高的效率，但其回收率仅小于1％。Qiagen，Inc.(Hilden，德国)提出了一种通过使用基于碳水化合物的吸附基质来吸附和除去抑制聚合酶链式反应(PCR)之材料的方法，但该方法对于纯化复杂样品(例如粪便样品)非常有效，但其回收率小于0.1％。此外，ZymoResearchCorp.(Irvine，美国)提出了一种通过使用500μm珠施加物理力来提取存在于粪便中的核酸的方法，但是由于未能除去存在于粪便样品中的多种杂质，因此存在其纯化率低的限制。因此，需要开发一种能够通过除去存在于复杂样品(例如粪便)中的多种杂质来提高核酸提取率的方法。
技术实现思路
技术问题本专利技术提供了一种用于从生物样品中提取核酸的方法，所述方法能够通过使用表面活性剂和亲液盐(kosmotropicsalt)来提高细菌和核酸的回收率，以有效地从生物样品中提取核酸。技术方案本专利技术的一个方面提供了用于从生物样品中提取核酸的方法，所述方法包括：(a)通过珠搅打(beadbeating)生物样品-珠溶液来使生物样品破碎，所述生物样品-珠溶液通过向生物样品添加缓冲溶液、表面活性剂和珠而制备；(b)分离破碎的生物样品-珠溶液；(c)通过向经纯化的溶液添加亲液盐溶液来进行再纯化；以及(d)从经再纯化的溶液中提取核酸。根据本专利技术的一个示例性实施方案，表面活性剂可为阴离子表面活性剂。根据本专利技术的一个示例性实施方案，基于生物样品的总重量，表面活性剂可以以1％至20％(v/v)的量存在。根据本专利技术的一个示例性实施方案，步骤(a)可为通过在10Hz至80Hz的条件下珠搅打生物样品-珠溶液来使生物样品破碎。根据本专利技术的一个示例性实施方案，纯化可通过离心或过滤进行。根据本专利技术的一个示例性实施方案，再纯化可通过离心或热处理进行。根据本专利技术的一个示例性实施方案，热处理可在50℃至90℃下进行。根据本专利技术的一个示例性实施方案，亲液盐溶液可为硫酸钠(Na2SO4)溶液。根据本专利技术的一个示例性实施方案，亲液盐溶液可为1.0M至5.0M溶液。根据本专利技术的一个示例性实施方案，生物样品可以是选自粪便、血液和土壤中的任一种。本专利技术的一个方面提供了用于从生物样品中提取核酸的方法，所述方法包括：(a)通过珠搅打生物样品-珠溶液来使生物样品破碎，所述生物样品-珠溶液通过向生物样品添加缓冲溶液、表面活性剂和珠而制备；(b)将其中生物样品被破碎的生物样品-珠溶液离心并纯化；(c)通过向经纯化的溶液添加亲液盐溶液并将所得混合物离心来进行再纯化；以及(d)从经再纯化的溶液中提取核酸。本专利技术的另一个方面提供了用于从生物样品中提取核酸的方法，所述方法包括：(a)通过珠搅打生物样品-珠溶液来使生物样品破碎，所述生物样品-珠溶液通过向生物样品添加缓冲溶液、表面活性剂和珠而制备；(b)过滤并纯化其中生物样品被破碎的生物样品-珠溶液；(c)通过向经纯化的溶液添加亲液盐溶液并进行热处理来进行再纯化；以及(d)从经再纯化的溶液中提取核酸。本专利技术的有益效果根据本专利技术，通过分别在生物样品的破碎和生物样品的纯化中添加表面活性剂和亲液盐溶液而有效地除去样品中的杂质，从而提高细菌和核酸的回收率并且表现出使得能够更灵敏且准确地检测病原体的效果。附图说明图1示出了根据表面活性剂浓度的总细菌回收、细菌回收率、核酸回收率和粪便分离。图2示出了根据硫酸钠(Na2SO4)浓度的总细菌回收和粪便分离。图3示出了根据热处理的总细菌回收、细菌回收率和核酸回收率。图4示出了根据离心强度的总细菌回收、细菌回收率、核酸回收率和粪便分离。图5示出了根据粪便样品类型的总细菌回收、细菌回收率和核酸回收率。图6示出了根据粪便样品的量的狗(顶部)和人(底部)粪便样品的分离和纯化结果。图7A示出了根据样品量的人血液样品的分离和纯化结果，并且图7B示出了根据本专利技术和市售试剂盒(Qiagen，Inc.)的病毒回收率和革兰氏阳性菌回收率。图8A示出了土壤样品的分离和纯化结果，并且图8B示出了土壤样品中的革兰氏阳性菌回收率。图9A示出了根据多种珠尺寸的粪便样品的核酸提取率，并且图9B示出了根据多种珠尺寸的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)核酸回收率。图10示出了使用过滤和离心的粪便样品的分离和纯化结果。图11A示出了通过热处理的粪便样品的再纯化结果，图11B示出了血液样品的再纯化结果，并且图11C示出了粪便样品中的核酸回收率。图12示出了使用非离心方法的粪便样品的分离和纯化结果，其中纯化步骤和再纯化步骤分别通过过滤和热处理进行。本专利技术的最佳实施方式本专利技术的一个方面提供了用于从生物样品中提取核酸的方法，所述方法包括：(a)通过珠搅打生物样品-珠溶液来使生物样品破碎，所述生物样品-珠溶液通过向生物样品添加缓冲溶液、表面活性剂和珠而制备；(b)纯化其中生物样品被破碎的生物样品-珠溶液；(c)通过向经纯化的溶液添加亲液盐溶液来进行再纯化；以及(d)从经再纯化的溶液中提取核酸。具体实施方式在下文中，将更详细地描述本专利技术。本专利技术的专利技术人在研究和开发用于从生物样品中提取核酸的方法期间揭示了当添加表面活性剂和亲液盐溶液以分别使生物样品破碎和纯化生物样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于从生物样品中提取核酸的方法，所述方法包括：(a)通过珠搅打生物样品‑珠溶液来使生物样品破碎，所述生物样品‑珠溶液通过向所述生物样品添加缓冲溶液、表面活性剂和珠而制备；(b)纯化其中所述生物样品被破碎的所述生物样品‑珠溶液；(c)通过向经纯化的溶液添加亲液盐溶液来进行再纯化；以及(d)从经再纯化的溶液中提取核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.26 KR 10-2016-0023251;2017.02.21 KR 10-2011.用于从生物样品中提取核酸的方法，所述方法包括：(a)通过珠搅打生物样品-珠溶液来使生物样品破碎，所述生物样品-珠溶液通过向所述生物样品添加缓冲溶液、表面活性剂和珠而制备；(b)纯化其中所述生物样品被破碎的所述生物样品-珠溶液；(c)通过向经纯化的溶液添加亲液盐溶液来进行再纯化；以及(d)从经再纯化的溶液中提取核酸。2.权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。3.权利要求1所述的方法，其中基于所述生物样品的总重量，所述表面活性剂以1％至20％(v/v)的量存在。4.权利要求3所述的方法，其中步骤(a)为通过在10Hz至80Hz的条件下珠搅打所述生物样品-珠溶液来使所述生物样品破碎。5.权利要求1所述的方法，其中所述纯化通过离心或过滤进行。6.权利要求1所述的方法，其中所述再纯化通过离心或热处理进行。7.权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵畯泓，白昶润，
申请(专利权)人：株式会社CTBIO，
类型：发明
国别省市：韩国,KR