研究诸如核酸之类的分子的方法技术

提供了一种操控不溶混的载体介质中的反应介质的微滴的方法，其中，为了实现化学转化的目的，目标分子被结合到固体支持物，其特征在于以下步骤：(a)在引起微滴和固体支持物结合的条件下使微滴与固体支持物接触；(b)让所述反应介质与所述目标分子反应和(c)之后施加力，以诱导所述反应介质从所述固体支持物脱离并在载体流体中重新形成微滴。在一个实施方案中，固体支持物是颗粒、珠子或类似物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】研究诸如核酸之类的分子的方法
本专利技术尤其涉及一种研究核酸分子(nucleicacidmolecule)的方法；特别是用于对天然或合成来源的DNA或RNA进行测序的方法。
技术介绍
在我们之前的申请WO2014/053853、WO2014/053854、WO2014/167323、WO2014/167324和WO2014/111723中，我们已经描述了一种新的测序方法，该方法涉及逐步消化多核苷酸分析物(polynucleotideanalyte)以产生有序的单核苷酸的流(stream)，优选地，单核苷三磷酸(singlenucleosidetriphosphates)流，它们的每一个可以被一个一个地捕获到微滴流中的相应微滴中。此后，可以对每个微滴进行化学和/或酶促(enzymatically)处理以揭示其最初包含的特定单核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶促处理包括一种涉及使用一种或多种多组分寡核苷酸探针类型(multi-componentoligonucleotideprobetypes)的方法，每种类型被适配为能够选择性地捕获构成分析物的单核苷酸类型之一。通常，在这样的探针类型中的每种中，所述寡核苷酸组分中的一个包含特征性荧光团(fluorophores)，并且在探针未使用的状态下，这些荧光团发出荧光的能力由于存在于附近的淬灭剂(quenchers)或通过自身淬灭(self-quenching)而消失。在使用中，当探针已捕获了其相应的单核苷酸，其变得易感于随后的核酸外切(exonucleolysis)或核酸内切(endonucleolysis)，从而使荧光团从淬灭剂中释放和/或从彼此释放，从而使它们能够自由地发出荧光。通过这种方式，可以通过光谱学手段间接地推断出存在于每个液滴中的原始单核苷酸的性质。在设计使用这种方法的测序设备时，可能需要操纵数千个微滴，以确保例如它们被可靠地递送到位，在微滴被递送到的位置，它们可以与其他微滴汇聚和/或它们的内含物依据是否存在荧光而被分析。这样做的一种可能的方式是在基底上建立路径，通过电润湿力可以沿着该路径推动微滴。用于以这种方式操控相对大的液滴的设备先前已经在本领域中被描述了；参见例如US6565727、US20130233425和US20150027889。通常，这是通过使液滴，例如在不溶混的(immiscible)载体流的存在下，穿过微流体空间来实现的，所述微流体空间由盒体(cartridge)的两个相对的壁限定或由管道限定。嵌在盒体壁或管道壁中的是覆盖有介电层的电极，每个电极都连接到AC偏置电路，该电路能够间歇地快速打开和关闭，以修改所述层的电润湿特性(electrowettingcharacteristics)。这引起局部化的方向性毛细作用力，该作用力可用于沿着给定的路径导控液滴。该方法的变体(基于以光学方式调节的电润湿)已经在例如US20030224528、US20150298125和US20160158748中被教导了。特别地，这三个专利申请中的第一个公开了各种微流体设备，所述微流体设备包括由第一壁和第二壁限定的微流体腔，并且其中第一壁是复合设计的并且包括基底、光电导层和绝缘(介电的)层。在光电导层和绝缘层之间设置有导电单元(conductivecells)阵列，所述导电单元彼此电隔离并耦合至光敏层(photoactivelayer)，并且它们的功能是在绝缘层上产生相应的离散的液滴接收位置。在这些位置，液滴的表面张力特性可以通过电润湿力来改变。所述导电单元则可以通过作用在光电导层上的光来接通或关断。该方法的优点在于使切换变得更加容易和快捷，尽管在某种程度上其使用仍受电极布置的限制。此外，对于液滴可以移动的速度以及实际液滴路径可以改变的程度存在限制。Pei在加利福尼亚大学伯克利分校的论文UCB/EECS-2015-119中公开了后一种技术的双壁实施例。在此，描述了一种单元，该单元通过横跨沉积在介电层上的TeflonAF的表面地使用以光学方式调节的电润湿来允许对尺寸在100-500μm范围内的较大液滴进行操控。在未图案化的电偏压(electricallybiased)非晶硅上的光图案(light-pattern)被以示意性的形式描述。然而，在所示方案中，介电层很薄(100nm)，并且仅设置在承载光敏层的壁上。MicrofluidNanofluid(2016)20：123讲授了在疏水微通道中的亲水部片上的电极辅助液滴捕获和释放。
技术实现思路
在我们最近提交的欧洲专利申请17180391.9中，我们已经公开了一种核酸研究(investigative)设备，该设备能够符合快速、可靠的单核苷酸检测方法的要求地同时操控数千个微滴。它的优点是可以通过计算机软件的应用轻松地重新配置以使其用途广泛；例如，通过允许用户容易地将其适配为用于最佳精度、通量(throughput)或检测特定的表观遗传修饰(epigeneticmodifications)。我们现在还开发了一种相应的研究方法，该方法的一个特征在于，初始分析物消化步骤通过使颗粒物支撑的分析物与水性微滴的流的组分直接相互作用来进行，所述水性微滴在不混溶的载体介质中含有上游(包括但不限于在分开的位置；例如在消化发生的基片(chip)的上游)产生的消化介质。通过这种方式，消化步骤可以“颗粒上”地且“液滴内”地执行，从而大大提高了该消化步骤的准确性和可靠性。在最广泛的范围内，并且认识到该方法是广泛适用的，根据本专利技术的第一方面，提供了一种操控不溶混的载体介质中的反应介质的微滴的方法，其中，出于实现化学转化的目的，目标分子被结合到固体支持物，其特征在于以下步骤：(a)在引起微滴和固体支持物结合的条件下使微滴与固体支持物接触；(b)让所述反应介质与所述目标分子反应和(c)之后施加力，以诱导所述反应介质从所述固体支持物上脱离并在载体流体中重新形成微滴。在该方法的一种形式中，提供了一种对目标分子进行化学转化的方法，其中所述目标分子被固定在固体支持物上的给定位置，所述固体支持物包括颗粒，所述方法的特征在于以下步骤：(a)产生微滴的流，每个微滴都包括能够导致所述化学转化发生的介质；(b)在能够发生化学转化的条件下，使每个微滴依次与所述目标分子在给定位置接触给定的时间段；以及(c)在给定时间段结束时，将微滴从给定位置移除。适当地，这些方法还包括将重新形成的微滴带离固体支持物的附近的步骤，该微滴从反应介质的组分来看已被耗尽。优选地，施加的力是电润湿力，该力被施加到包括固体支持物的位置的路径上的各个点或区域上。该电润湿力可以以电学方式产生或以光学方式产生。在一个实施方案中，所采用的反应介质是用于转化核酸(nucleicacid)分析物的，并且目标分子是多核苷酸(polynucleotide)；例如使用单链多核苷酸作为引物/模板(primer/template)的合成核酸(例如RNA或DNA)。在这样的实施方案中，施加至固体支持物的微滴将包含核苷酸单体(nucleotidemonomers)的源、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种操控不溶混的载体介质中的反应介质的微滴的方法，其中，为了实现化学转化的目的，目标分子被结合到固体支持物，其特征在于以下步骤：(a)在引起微滴和固体支持物结合的条件下使微滴与固体支持物接触；(b)让所述反应介质与所述目标分子反应和(c)之后施加力，以诱导所述反应介质从所述固体支持物脱离并在载体流体中重新形成微滴。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170621 EP 17177204.9;20171218 EP 17208257.01.一种操控不溶混的载体介质中的反应介质的微滴的方法，其中，为了实现化学转化的目的，目标分子被结合到固体支持物，其特征在于以下步骤：(a)在引起微滴和固体支持物结合的条件下使微滴与固体支持物接触；(b)让所述反应介质与所述目标分子反应和(c)之后施加力，以诱导所述反应介质从所述固体支持物脱离并在载体流体中重新形成微滴。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应介质是用于转化核酸分析物的介质，并且所述目标分子包括多核苷酸。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，核苷酸被从分析物中释放出来，并在微滴中被从固体支持物附近带走。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使多个微滴顺序地与分析物接触，每个微滴都能够带走核苷酸。


5.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学转化用于确定核酸分析物的序列，并且所述方法的特征在于包括以下步骤：
·使不混溶的载体介质中的包括消化介质的反应介质的微滴的流在路径中逐一接触目标分子，所述目标分子包括与固体支持物结合的核酸分析物，所述固体支持物包括颗粒，从而使分析物逐步被消化成其组成核苷酸；
·从分析物周围移除微滴，其中所述微滴中的至少一些微滴包含单个核苷酸；
·进一步将微滴沿路径运送到检测区，和
·在检测区识别微滴中的单体单元，并由此推断所述分析物分子的序列。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述消化介质包含聚合酶和辅因子，所述辅因子使所述聚合酶从所述分析物分子逐个地释放核苷酸。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述辅助因子是多磷酸根阴离子或其类似物。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多磷酸盐根是焦磷酸根。


9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述消化介质包含核酸外切酶，并且由此释放的核苷酸单磷酸被进一步用激酶处理以将其转化为核苷酸三磷酸。


10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其特征在于，在聚合酶的存在下，使所得的核苷酸与包含荧光探针的寡核苷酸捕获系统反应，所述荧光探针在其未使用状态下是不发出荧光的，并且所述荧光探针对至少一种所述分析物的特征核苷酸类型具有选择性，导致荧光团到可检测状态的释放，并且其中，使用第一电磁辐射的入射源和光电检测器检测每个微滴中释放的荧光团产生的荧光。


11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，荧光团的释放是核酸内切酶和/或核酸外切酶和可选的连接酶的作用的结果，这种作用通过被检测的核苷酸的捕获被催化。


12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，通过液滴汇聚或通过直接注射将寡核苷酸捕获系统引入到所述颗粒下游的微滴中。


13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其特征在于，在与所述寡核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡梅伦·亚历山大·弗雷林，佩德罗·昆哈，托马斯·亨利·艾萨克，
申请(专利权)人：贝斯四创新公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB