新一代抗原-特异性TCR制造技术

本发明专利技术涉及用于产生人抗原‑特异性T淋巴细胞的方法。该方法采用与抗原或其片段融合的MHC II类靶向信号以获得经过RNA编码的蛋白质的MHC类递呈。因此，本发明专利技术涉及包含MHC II类靶向信号和至少一种抗原或其片段的表达载体及其用于体外产生抗原‑特异性T淋巴细胞的用途。还描述了对肿瘤抗原或病毒抗原具有特异性的T细胞克隆和T细胞受体(TCR)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新一代抗原-特异性TCR
本专利技术涉及用于产生人抗原-特异性T淋巴细胞的方法。该方法采用与抗原或其片段融合的MHCII类靶向信号以获得经过RNA编码的蛋白质的MHCI类和II类递呈。因此，本专利技术涉及包含MHCII类靶向信号和至少一种抗原或其片段的表达载体及其用于体外产生抗原-特异性T淋巴细胞的用途。还描述了对肿瘤抗原或病毒抗原具有特异性的T细胞克隆和T细胞受体(TCR)。
技术介绍
过继性T细胞转移采用基于T细胞的细胞毒性反应来控制慢性病毒感染和肿瘤。在体外产生对患者癌症具有天然反应性或基因工程化反应性的T细胞，然后将该T细胞转移返回至患者体内。已经将过继转移自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)用于成功治疗晚期肿瘤患者。TIL疗法在临床上的广泛应用的主要局限性在于肿瘤的免疫原性通常很差，以及从胸腺中选择消极T细胞的机制，该机制有效地去除具有自身抗原-特异性的T细胞。因此，在许多情况下，无论是对肿瘤特异性抗原具有较高亲和力的T细胞，还是具有所需特异性的T细胞，都不能将它们从患者血液或肿瘤切除物中分离出来。为此，转移以基因方式重新引导的外周血淋巴细胞(PBL)为克服这些限制提供了可能性。此外，T淋巴细胞在癌症和慢性感染中丧失功能并耗尽。在T细胞受体(TCR)基因疗法的帮助下，可以从患者血液中快速地产生数百万个肿瘤反应性T细胞。TCR基因疗法开创了灵活方法以将肿瘤特异性转移至可扩增且在功能上有希望的T细胞亚群。该方法包括将限定的抗原-特异性T细胞克隆的经分离的TCR基因转移至与人类白细胞抗原(HLA)匹配的供体的受体T淋巴细胞中，以使该受体T淋巴细胞具有所需的抗原-特异性。对于癌症或病毒疾病，采用CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的过继性T细胞疗法是一种有希望的免疫疗法。为了增强临床反应，互补性转移CD4+辅助性T细胞为增强CD8+CTL反应提供了可能性。已知CD4+T淋巴细胞为CD8+CTL提供了关键性帮助，并且对长效CD8+记忆T细胞的产生具有关键作用。因此，快速且有效地分离和表征肿瘤抗原-特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞是重要的。许多肿瘤表达MHCII类分子，因此来自CD4+T细胞的TCR对攻击直接攻击这些肿瘤特别有用。为了扩展采用过继性细胞疗法(ACT)来治疗患有生长更快的肿瘤或慢性病毒性疾病的患者的能力，目标是转移富集的肽特异性效应T细胞(CD4T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞，这些细胞因其配体特异性而被选择)以有效地攻击病毒或肿瘤细胞，同时避免严重攻击正常组织。将这些细胞离体迅速地大量扩增，然后将其用于ACT。可替换地，采用受体外周血淋巴细胞或具有定义的特异性的激活的T细胞克隆(生长良好且没有攻击正常宿主组织的能力)，可以克隆这些配体特异性T细胞的T细胞受体(TCR)，并将它们作为TCR转基因在激活的淋巴细胞中表达。因此，需要抗原-特异性TCR和分离这些TCR的有效方法。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供用于分离具有抗原-特异性TCR的T细胞的有效方法。提供用于产生CD4TCR和/或CD8TCR的方法将是期望的。此外，本专利技术的目的是提供TCR或其功能部分(如CDR3区)。实现对肿瘤抗原表现出较高和/或最佳亲和力的TCR将是有利的。因此，本专利技术的第一方面涉及产生人抗原-特异性T淋巴细胞的方法，包括以下步骤：A)在抗原递呈细胞中表达至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含-至少一种抗原或其片段，-在抗原N-末端前端的内质网(ER)-易位信号序列，和-在抗原C-末端后端的包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域；和B)在体外将包含T淋巴细胞的细胞群暴露于步骤A)的抗原递呈细胞，以激活对由抗原递呈细胞表达的抗原具有特异性的抗原-特异性T淋巴细胞。将靶向序列(特别是与ER-易位信号序列组合)与所需抗原或其片段融合允许有效地加载MHCII类复合物，还用于通常经由MHCI类复合物递呈的细胞内蛋白质。通过上述方法也可以实现对MHCI类复合物的加载。因此，该方法允许产生CD4+TCR和CD8+TCR。至少一种步骤A)中的融合蛋白的表达可以是瞬时表达或稳定表达，优选瞬时表达，例如通过引入编码至少一种融合蛋白的ivt-RNA。ivt-RNA表达的优点为可以快速产生质量受控的ivt-RNA并且该ivt-RNA不携带免疫原性蛋白质污染物。在具体的实施方式中，融合蛋白可以包含至少两种抗原或其片段。在一些实施方式中，该方法可以进一步包括富集激活的T淋巴细胞的步骤。该富集步骤通常包括以下步骤：(a)将包含激活的抗原-特异性T淋巴细胞的细胞群与至少一种结合分子接触，该结合分子与至少一种由激活的T淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白质特异性结合；(b)分离与至少一种结合分子结合的T淋巴细胞。在优选的实施方式中，由激活的T淋巴细胞特异性表达的至少一种标志物蛋白质选自包括以下各项的组：Ox40、CD137、CD40L、PD-1、IL-2受体、干扰素γ、IL-2、GM-CSF和TNF-α。另外，在步骤(a)中，细胞可以进一步与特异性结合至CD4的结合分子和/或与特异性结合至CD8的结合分子接触。在具体的实施方式中，选择激活的CD4T细胞包括以下步骤：(a1)使步骤B)的细胞群与抗CD40的抗体接触，以阻断抗原递呈细胞的CD40-CD40L与抗原-特异性T淋巴细胞之间的相互作用，并使CD40L在T淋巴细胞表面积累；(a2)使包含激活的抗原-特异性T淋巴细胞的细胞群与抗-CD40L抗体接触；(b)分离标记有抗-CD40L抗体和抗-CD4抗体的T淋巴细胞。另一个实施方式涉及根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法还包括以下步骤C2)鉴定抗原-特异性T淋巴细胞，包括以下步骤：a)将包含激活的抗原-特异性T淋巴细胞的细胞群的扩增细胞克隆与以下各项孵育(i)如步骤A)中定义的抗原递呈细胞，和(ii)对照抗原递呈细胞；b)比较每种细胞克隆与(i)和(ii)孵育的激活特征；c)基于b)的比较，鉴定抗原-特异性细胞克隆；其中，被(i)激活但不被(ii)激活表明细胞克隆是抗原-特异性的；被(i)激活并且被(ii)激活表明细胞克隆是抗原非特异性的；既不被(i)激活也不被(ii)激活表示细胞克隆未被激活。在步骤B)中，至少一次、或至少两次、或至少三次或三次将抗原递呈细胞添加至包含T淋巴细胞的细胞群。重复添加抗原递呈细胞之间的时间间隔可以是7至21天、12至16天、或13至15天、或14天。ER易位信号序列来源于内体/溶酶体相关蛋白。内体/溶酶体相关蛋白可以选自由LAMP1、LAMP2、DC-LAMP、CD68或CD1b所组成的组，优选地内体/溶酶体相关蛋白是LAMP1。优选地，ER易位信号序列源于人类。在具体的实施方式中，ER易位信号序列包含序列SEQIDNO：33或其片段。在更具体的实施方式中，ER易位信号序列由以下序列SEQIDNO：33组成。包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域可以来源于LAMP1或DC-LAMP，优选DC-LAMP。优选地，包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域源于人类。通常，抗原递呈细胞选自树突细胞、激活的B细胞、单核细胞、巨噬细胞、EBV转化的淋巴母细胞系，优选树突细胞，更优选单核细胞衍生的树突细胞。通常，包含T淋巴细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生人抗原‑特异性T淋巴细胞的方法，包括以下步骤：A)在抗原递呈细胞中表达至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含‑至少一种抗原或其片段，‑在所述抗原N‑末端前端的内质网(ER)‑易位信号序列，和‑在所述抗原C‑末端后端的包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域；和B)在体外将包含T淋巴细胞的细胞群暴露于步骤A)的所述抗原递呈细胞，以激活对由所述抗原递呈细胞表达的抗原具有特异性的抗原‑特异性T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.23 EP 15202329.7;2016.09.23 EP 16190399.21.一种产生人抗原-特异性T淋巴细胞的方法，包括以下步骤：A)在抗原递呈细胞中表达至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含-至少一种抗原或其片段，-在所述抗原N-末端前端的内质网(ER)-易位信号序列，和-在所述抗原C-末端后端的包含内体/溶酶体靶向序列的跨膜胞质结构域；和B)在体外将包含T淋巴细胞的细胞群暴露于步骤A)的所述抗原递呈细胞，以激活对由所述抗原递呈细胞表达的抗原具有特异性的抗原-特异性T淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包含至少两种抗原或其片段。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤C1)富集激活的和/或抗原-特异性的T淋巴细胞，其包括以下步骤：(a)将包含激活的抗原-特异性T淋巴细胞的细胞群与结合分子或与递呈所需抗原的表位的MHC分子接触，所述结合分子与由激活的T淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白特异性结合；(b)分离与所述结合分子或所述递呈所需抗原的表位的MHC分子结合的T淋巴细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述由激活的T淋巴细胞特异性表达的标志物蛋白选自由Ox40、CD137、CD40L、PD-1、IL-2受体、干扰素γ、IL-2、GM-CSF和TNF-α所组成的组。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤C2)鉴定抗原-特异性T淋巴细胞，包括以下步骤：a)将包含激活的抗原-特异性T淋巴细胞的细胞群的扩增细胞克隆与以下各项孵育(i)如步骤A)中定义的抗原递呈细胞，和(ii)对照抗原递呈细胞或不存在抗原递呈细胞；b)比较每种细胞克隆与(i)和(ii)孵育的激活特征；c)基于b)的所述比较，鉴定抗原-特异性细胞克隆；其中，被(i)激活但不被(ii)激活表明所述细胞克隆是抗原-特异性的。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ER易位信号序列来源于内体/溶酶体相关蛋白，并且其中所述内体/...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯拉沃柳布·米洛舍维奇，克里斯蒂安·埃林格尔，卡里娜·韦纳，德洛利斯·申德尔，
申请(专利权)人：基因医疗免疫疗法有限责任公司，健康与环境慕尼黑德国研究中心赫姆霍茨中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE