非造血组织驻留γδT细胞的扩增及这些细胞的用途制造技术

本发明专利技术涉及通过在白细胞介素‑2(IL‑2)和/或白细胞介素‑15(IL‑15)存在下并且在没有TCR激活或共刺激信号的情况下，在没有与基质细胞或上皮细胞直接接触的情况下，通过培养从人或非人动物的非造血组织获得的淋巴细胞在体外扩增非造血组织的γδT细胞。提供了非造血组织驻留γδT细胞扩增的方法以及非造血组织驻留γδT细胞的群体及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】非造血组织驻留γδT细胞的扩增及这些细胞的用途
本专利技术涉及一种用于离体(exvivo)扩增非造血组织驻留γδT细胞的方法。术语“非造血组织驻留γδT细胞”是指驻留在非造血组织内而不是在淋巴器官和血液内的T淋巴细胞的亚群。这样的细胞包括非Vδ2细胞，例如，Vδ1、Vδ3和Vδ5细胞。本专利技术还涉及这些细胞在过继性T细胞治疗和在嵌合抗原受体疗法中的用途，以及它们在筛查检查点调节剂(checkpointmodulator)的方法中的用途。本专利技术还涉及作为非造血组织驻留γδT细胞的离体扩增的结果而产生的细胞。
技术介绍
在用于癌症的T细胞免疫治疗方面的兴趣日益增加，这些兴趣集中在CD8+(1-4)和CD4+αβ(5，6)T细胞亚群识别癌细胞和介导宿主保护功能潜能的明显能力上，特别是当由PD1(7，8)、CTLA4(9，10)和其他受体(11)发挥的抑制途径的临床介导的拮抗作用而脱阻抑时。尽管如此，依然存在许多问题。例如，似乎有许多主要的临床情景，其中这种治疗的疗效似乎很差(11)；通常存在严重的不良事件(AE)(12)；预测效力或AE的能力非常有限(13)；并且对允许宿主感知肿瘤细胞的相互作用(所谓的“免疫原性”)的解释非常少，其必须优先于传统的抗原特异性CD8+和CD4+αβT细胞应答的激活。在此方面，许多科学家和临床医生都以同样的方式重新评估γδT细胞的潜力，γδT细胞是具有体细胞生成受体(somatically-generatedreceptors)的淋巴细胞的第三谱系，其在进化上与αβT细胞和B细胞高度保守。实质上存在人γδT细胞的两个亚群：一个在人外周血中占优势，主要表达Vδ2T细胞受体(TCR)；而另一个在非造血组织中占优势，大多数表达Vδ1TCR，具有表达包含Vδ3或Vδ5链或一些其他非Vδ2链的TCR的较小的群体(14)。在大多数成人中，Vδ2细胞在稳定状态下仅包含小的且高度可变的血液T细胞成分(0.01-5％)，但细胞迅速扩增，瞬时达到高达约25％的CD3+细胞，随后受到包括许多细菌和寄生虫的广谱试剂挑战(14)。该反应的主要基础是低分子量“磷酸部分”的Vδ2TCR-介导的识别，包括羟基-甲基丁-2-烯基焦磷酸酯(HMBPP)(15)，其是合成胆固醇和合成用于修饰蛋白质(例如通过香叶基化或法尼基化)的其他脂质的关键微生物途径中的中间体。在灵长类中，这种合成通过甲羟戊酸(mevalonate)途径发生，其中一种中间体-异戊烯焦磷酸(IPP)在病毒感染的和转化的细胞中以非常高的水平表达，并且也是Vδ2TCR介导的识别的靶标(16)。此外，大多数Vδ2T细胞表达高水平的NKG2D受体，其可以在接合NKG2D配体如MICA、MICB和ULBP时(与TCR一起)激活或共刺激细胞的细胞溶解潜力。那些配体是当细胞被暴露于如氧化性的试剂或渗透性应激或紫外线时上调的宿主蛋白质。这些试剂促进表皮生长因子受体(EGFR)途径的超活性信号转导，其通常在人实体瘤中也是失调的(17)。Vδ2T细胞使用它们的TCR和/或NKG2D检测转化细胞的能力(18-20)、连同它们强大的细胞溶解能力以及将抗原呈递给CD8+T细胞的明显潜力(21)，已经共同引发了Vδ2T细胞可能在临床上被用来递送癌症免疫治疗的观点。这可以通过细胞过继转移来实现，其中认为γδT细胞的衰竭被MHC限制显著且有利地限制了移植物抗宿主病(GvHD)的可能性(22)。为了实现这一点，可以通过添加细胞因子如白介素(IL)-2，连同外源性TCR激活剂如磷酸部分(例如，BrHPP)，或连同抑制甲羟戊酸途径中的法尼基焦磷酸合成酶的临床批准的双膦酸(例如，唑来膦酸)来离体扩增血液驻留Vγ9Vδ2γδT细胞，从而诱导TCR激活部分IPP的累积。然而，通过诸如BrHPP的试剂对Vγ9Vδ2细胞的慢性激活可以逐渐导致细胞耗尽并降低细胞毒性的可能性。可替代地，可以使用HMBPP的药理学修饰形式或临床批准的氨基双膦酸原位激活患者自身的γδT细胞。通过这些方法，超过250名癌症患者得到了治疗，看似安全，但仅有极少完全缓解的发生率。关于细胞有限的临床疗效的一个主要问题是它们变为由慢性抗原暴露不能恢复地耗尽的倾向性。第二个主要问题是它们在归巢于实体瘤和包容这些肿瘤的组织时看起来效率低下(23)。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗显示出在针对B细胞恶性肿瘤的临床中的前景。然而，就治疗实体瘤而言，迄今为止CAR-T细胞的表现一直低于预期，表现出在诱导完全肿瘤应答方面的较低效力和脱靶(off-tumour)细胞毒性的高发生率(24)。对于外周血γδT细胞，实体瘤的CAR-T方法成功的主要障碍可能性是全身CAR-T细胞迁移至恶性肿瘤部位并以功能有效状态驻留其中的效率低下(25)。此外，由于基于常规αβT细胞，CAR-T细胞必须克服肿瘤微环境中的免疫抑制信号，例如，通过PD1受体传递的那些。可能有与使用针对CAR-T方法的γδT细胞相关的优势，因为可以用肿瘤反应性嵌合抗原特异性TCR转导它们，同时保留它们使用受体如NKG2D识别转化细胞的先天能力。因此，它们可能同时施加肿瘤适应性(TCR)和先天性(NKG2D)介导的效应。然而，仍然存在人血液γδT细胞在归巢至固体组织内的肿瘤并且在其中保持活性形式时看起来效率低的问题。这一考虑因素激发了对通常存在于非造血组织中的γδT细胞的更详细的考虑。作为它们的发展的一部分，这样的T细胞迁移到非造血组织并且因此与那些T细胞不同，那些T细胞例如在全身性引发后浸润组织的组织驻留TCRαβ+记忆T细胞(所谓的TRM细胞)。组织驻留γδT细胞在小鼠中得到最充分的研究，其中它们已被证明在皮肤、肠道和生殖组织以及其他部位普遍存在。已证实许多此类细胞具有先天样(innate-like)功能性潜能，借此它们可以通过激活NKG2D受体来响应于挑战。本专利技术人最近获得的数据表明，人皮肤和肠同样拥有具有先天样活性的非造血组织驻留γδT细胞的大区室。然而令人惊讶的是，在非造血组织内形成的恶性肿瘤、炎症、特应性疾病、变态反应和其他病理学的研究很大程度上未能考虑驻留在其中发生病理损害的组织中的这些先天样人T细胞的潜在影响。驻留在非造血组织中的人γδT细胞被研究得很少，这是由于它们的定位使得细胞更难以取样，并且因为尚未建立培养它们的手段。在可获得的相对稀少的信息中，该亚型包含具有非MHC限制性细胞溶解潜能的多样性细胞，由于它们不表达含有Vγ2的TCR，因此它们与低分子量磷酸部分是完全不反应的。尽管对于这些细胞已知很少精确的TCR特异性，但可获得的数据表明，细胞对自体抗原是反应性的，自体抗原例如是由巨细胞病毒(CMV)感染的细胞和许多实体瘤过度表达的内皮蛋白C受体(EPCR)(32)。非造血组织相关的γδT细胞也通常表达NKG2D(14)。鉴于这些性质以及细胞在非造血组织如皮肤和肠道内的生理学驻留，将这些细胞过继转移给癌症患者可能在靶向实体肿瘤和潜在的其他免疫病理学方面更有效。为了开发用于免疫疗法的非Vδ2细胞，需要原位扩增细胞或收集它们并在再输注前离体扩增它们的手段。已经采用后一种方法，因为没有已知的TCR激活剂具有证实的原位扩增大量非Vδ2细胞的能力。为了克服非造血组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于体外扩增非造血组织驻留γδT细胞的方法，所述方法包括在白细胞介素‑2(IL‑2)和/或白细胞介素‑15(IL‑15)的存在下培养从人或非人动物的非造血组织获得的淋巴细胞，其中，在培养期间，所述淋巴细胞不与基质细胞或上皮细胞直接接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 GB 1519198.4;2016.07.22 GB 1612731.81.一种用于体外扩增非造血组织驻留γδT细胞的方法，所述方法包括在白细胞介素-2(IL-2)和/或白细胞介素-15(IL-15)的存在下培养从人或非人动物的非造血组织获得的淋巴细胞，其中，在培养期间，所述淋巴细胞不与基质细胞或上皮细胞直接接触。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在培养期间，所述淋巴细胞不与成纤维细胞直接接触。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法包括在IL-2的存在下培养从人或非人动物非造血组织获得的所述淋巴细胞。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法包括在白细胞介素-15(IL-15)的存在下培养从人或非人动物非造血组织获得的所述淋巴细胞。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法包括在IL-2和IL-15的存在下培养从人或非人动物非造血组织获得的所述淋巴细胞。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括在不存在TCR激活或共刺激信号的情况下培养所述淋巴细胞。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括在不存在T细胞受体途径激动剂的情况下培养所述淋巴细胞。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在不存在基质细胞或上皮细胞的情况下培养所述淋巴细胞。9.根据权利要求8所述的方法，其中，在培养之前去除所述基质细胞或上皮细胞。10.根据权利要求8所述的方法，其中，在不存在成纤维细胞的情况下培养所述淋巴细胞。11.根据权利要求10所述的方法，其中，在培养之前去除所述成纤维细胞。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在包含IL-2和/或IL-15的γδ扩增培养基中培养所述淋巴细胞。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述γδ扩增培养基不激活或共刺激T细胞受体。14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法，其中，所述γδ扩增培养基不包含除IL-2和/或IL-15以外的生长因子。15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中，所述γδ扩增培养基由补充有IL-2和/或IL-15的基础培养基组成。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，已经从皮肤、胃肠道(例如，结肠)、乳腺组织、肺、肝脏、胰腺或前列腺获得所述淋巴细胞。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述γδT细胞是非Vδ2细胞。18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述γδT细胞是Vδ1细胞。19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述γδT细胞是双阴性(DN)γδT细胞。20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括从人或非人动物组织获得所述淋巴细胞的步骤。21.根据权利要求20所述的方法，其中，从人或非人动物非造血组织的样品获得所述淋巴细胞。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，组织包含非造血细胞和淋巴细胞。23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中，所述方法包括提供人或非人动物非造血组织的样品，以及将所述样品的淋巴细胞与非造血细胞分离以产生基本上不包含基质细胞的淋巴细胞的群体。24.一种扩增γδT细胞的方法，所述方法包括：(i)提供从非造血组织获得的γδT细胞的群体；和(ii)在基本上没有与所述γδT细胞接触的基质细胞的条件下培养所述γδT细胞以产生扩增的γδT细胞的群体。25.根据权利要求24所述的方法，其中，从非造血组织获得的γδT细胞的群体是基本上纯的γδT细胞的群体。26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中，从非造血组织获得的γδT细胞的群体是非Vδ2细胞。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述非Vδ2细胞的群体包含Vδ1细胞。28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中，所述非Vδ2细胞的群体包含DNγδT细胞。29.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中，从非造血组织获得的γδT细胞的群体包含Vδ1+CLA+CCR8+CD103+γδT细胞。30.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，其中，在γδT细胞和基质细胞之间没有接触的情况下进行步骤(ii)的培养。31.根据权利要求24-30中任一项所述的方法，其中，在基本上没有TCR激活信号或共刺激信号的条件下培养步骤(ii)的所述γδT细胞。32.根据权利要求24-31中任一项所述的方法，其中，在不存在TCR激活信号或共刺激信号的情况下进行步骤(ii)的培养。33.根据权利要求24-32中任一项所述的方法，其中，在基质细胞条件培养基中进行步骤(ii)的培养。34.根据权利要求24-33中任一项所述的方法，其中，在存在IL-2、IL-15或它们的组合的情况下进行步骤(ii)的所述γδT细胞培养。35.根据权利要求24-34中任一项所述的方法，其中，从人或非人动物非造血组织的样品获得所述γδT细胞的群体。36.根据权利要求24-35中任一项所述的方法，其中，非造血组织包含非造血细胞和γδT细胞。37.根据权利要求24-36中任一项所述的方法，其中，所述方法包括使所述γδT细胞与所述非造血细胞分离以产生包含基本上没有基质细胞的γδT细胞的分离的淋巴细胞的群体。38.根据权利要求24-37中任一项所述的方法，其中，在包含IL-2和/或IL-15的γδ扩增培养基中培养所述γδT细胞。39.根据权利要求24-38中任一项所述的方法，其中，所述γδ扩增培养基不激活或共刺激T细胞受体。40.根据权利要求24-39中任一项所述的方法，其中，所述γδ扩增培养基没有除IL-2和/或IL-15以外的生长因子。41.根据权利要求24-40中任一项所述的方法，其中，所述γδ扩增培养基由补充有IL-2和/或IL-15的基础培养基组成。42.一种扩增γδT细胞的方法，所述方法包括：(i)提供非造血组织，所述组织包含非造血细胞和γδT细胞；(ii)将所述γδT细胞与所述非造血细胞分离以产生包含基本上不包含基质细胞的γδT细胞的分离的群体；和(iii)在不存在TCR激活信号或共刺激信号的情况下培养步骤(ii)的所述分离的群体以产生扩增的γδ细胞的群体。43.根据权利要求42所述的方法，其中，步骤(ii)的分离还包括将所述γδT细胞与αβT细胞分离。44.根据权利要求42或43所述的方法，其中，所述步骤(ii)的分离的群体是基本上纯的γδT细胞的群体。45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中，所述步骤(ii)的分离的群体是非Vδ2细胞。46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述非Vδ2细胞的群体包含Vδ1细胞。47.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中，所述非Vδ2细胞的群体包含DNγδT细胞。48.根据权利要求42-...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿德里安·海戴，奥利弗·努斯鲍莫，理查德·伍尔夫，
申请(专利权)人：癌症研究技术有限公司，伦敦王室学院，弗兰西斯克里克研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB