具有精氨酸酶活性的融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及包含靶标结合部分、细胞内信号传导区和精氨酸酶结构域的融合靶标结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)。这些蛋白质赋予的优势包括细胞杀伤提高和增殖增加。本发明专利技术还涉及编码融合靶标结合蛋白的核酸和表达此类蛋白质的细胞。本发明专利技术涉及药物组合物、医疗用途和治疗方法，均使用所公开的融合靶标结合蛋白、细胞或核酸。所述医疗用途和治疗方法在癌症治疗中特别有益。疗中特别有益。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有精氨酸酶活性的融合蛋白


[0001]本专利技术涉及融合靶标结合蛋白以及包含此类蛋白的细胞，还涉及编码融合靶标结合蛋白的核酸。本专利技术涉及药物组合物、医疗用途和治疗方法，均使用所公开的融合靶标结合蛋白、细胞或核酸。

技术介绍

[0002]具有靶标结合能力的融合蛋白已被用于若干治疗应用。最值得注意的是，经过工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞已被用于癌症治疗。然而，如下文进一步所讨论的，尽管显示出相当大的临床前景，但此类治疗并未普遍有效。临床前和临床研究中的CAR
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T失败
[0003]尽管针对成人和儿科癌症的细胞毒性化疗取得了进展，但很明显，许多主要癌症亚型的预后仍然极差。免疫疗法提供了直接靶向恶性癌细胞的替代方法，避免了标准方法对正常细胞的毒副作用。
[0004]嵌合抗原受体(CAR)
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T细胞(CAR
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T)是源自患者的自体T细胞，经过工程化，通常带有抗体片段(scFv)，以特异性识别肿瘤细胞上的表面抗原。已经在使用抗CD19 CAR T细胞经历快速和持续缓解的化疗耐药性、复发性儿科B型急性淋巴细胞白血病患者中建立了使用CAR
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T细胞成功治疗儿科癌症的原理论证。在实体瘤中，儿童期最常见的实体癌神经母细胞瘤已经成为选择模型，并被证明在实体瘤对CAR
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T细胞疗法的反应中提供了大量信息。临床前研究表明，识别双唾液酸神经节苷脂2(GD2)抗原的CAR T细胞可以代表杀伤神经母细胞瘤细胞的强大的新方法。尽管神经母细胞瘤已成为CAR
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T细胞开发对抗实体瘤的范例，但在临床前模型和早期试验中仅观察到有限的抗肿瘤功效。第一代抗GD2 CAR T细胞无法在体内持续存在，并且具有最小的抗肿瘤作用。第二代抗GD2
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CAR T细胞(具有CD28或4
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1BB共刺激结构域)在体内的持久性改善，导致适度的肿瘤消退，但在神经母细胞瘤的存在下变得功能衰竭。在人类中，一项针对抗GD2 CAR T细胞的研究得出了关键观察结果，即尽管输注了大量的这些细胞，但CAR T细胞数量在数周内变得很低或无法检测到，并且大多数患有活动性疾病的患者没有实现完全缓解。重要的是，具有低水平的CAR T细胞持久性的患者生存期更长。这些发现表明，局部和全身肿瘤微环境损害了CAR
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T细胞的持久性，尽管残余的神经母细胞瘤肿瘤上存在大量靶抗原负载。
[0005]CAR
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T细胞疗法也已在体外、体内和人体中针对有限数量的其他实体瘤进行了测试。在每种情况下，针对这些恶性肿瘤的结果都未能复制在ALL中发现的抗CD19 CAR
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T细胞的令人兴奋的数据。
[0006]急性髓系白血病
[0007]急性髓系白血病是成人最常见的急性白血病和儿童期第二常见的白血病。发病率随着年龄的增长而增加，对于有高危或复发性疾病的患者，尽管进行了造血干细胞移植，成人生存期<12个月的预后极差。对于老年患者或有共存疾病的患者，标准化疗方案的耐受性较差，导致治疗欠佳，且无法实现治愈。几乎没有开发出针对AML的有效的新药，尽管此类免
疫疗法提供了不同方法的可能性。CD33在AML原始细胞上几乎普遍表达，并已被证明是基于免疫毒素的疗法(吉妥珠单抗)的有效靶点。抗CD33 CAR
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T细胞在体外对AML原始细胞具有细胞毒性，并在体内消除白血病负担。在此基础上，中国已经启动了抗CD33 CAR T细胞的I期临床试验(NCT01864902和NCT02958397)。来自1名化疗难治性AML患者的报告显示骨髓AML原始细胞减少。这些结果提供了抗CD33 CAR T细胞有效的原理论证。然而，尽管血液和骨髓中都存在可测量的CAR
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T细胞，但在CAR输注后9周，疾病复发。这一发现表明白血病微环境已经致使CAR
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T细胞无活性(没有证据表明AML原始细胞上的CD33丢失是逃逸机制)。
[0008]间皮瘤、卵巢癌和胰腺癌
[0009]石棉相关的肿瘤间皮瘤在成人中几乎普遍预后不良，它表达细胞表面糖蛋白间皮素。间皮素也表达于上皮癌，例如卵巢癌、肺腺癌和胰腺癌。间皮素已被证明是免疫毒素(例如SS1P)被动免疫疗法的有效和选择性靶标，导致其被选择用于CAR T技术的开发。在小鼠模型中，抗间皮素CAR
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T细胞表现出明显且持久的抗肿瘤活性。抗间皮素CAR
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T细胞也被施用于这些肿瘤患者，并且尽管在每个病例中检测到有限的反应(PR,SD)，但肿瘤仍在进展。CAR
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T细胞的持久性极差，在最初或重复给药的仅几天内就无法检测到细胞。即使当CAR
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T细胞被置于肿瘤内，因此与靶抗原非常接近，反应仍然很弱，表明存在强大的免疫抑制微环境降低了T细胞的功能。
[0010]胶质母细胞瘤
[0011]胶质母细胞瘤是成人和儿童最具破坏性的脑肿瘤之一，尽管采用了基于强化化疗和放疗的方案，但患者经常经历快速的疾病进展和治疗失败。胶质母细胞瘤表达表皮生长因子受体的变体
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EGFRvIII，提供了可以被免疫疗法靶向的肿瘤特异性抗原。EGFRvIII也可能在大约三分之一的晚期结直肠癌中表达。抗EGFRvIII CAR
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T细胞证明了对原位小鼠异种移植中胶质母细胞瘤的疾病控制。然而，尽管在包括大脑在内的所有器官中都可检测到CAR
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T细胞水平，但在所有情况下，肿瘤都继续生长，导致小鼠死亡。该数据再次表明CAR
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T细胞被肿瘤微环境失活。基于该基本原理的I期试验目前正在进行中(NCT02844062,NCT02664363)。
[0012]精氨酸和免疫抑制微环境
[0013]精氨酸是半必需氨基酸，是健康组织在许多细胞过程中所需的，包括细胞活力、增殖和蛋白质合成。全身精氨酸水平主要通过饮食摄入维持，并且通过“肠
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肾轴”中的前体合成维持在较小程度上。在细胞水平上，精氨酸通过阳离子氨基酸(CAT；SLC7A)转运蛋白家族从细胞外液中输入并进入尿素循环。在炎症、妊娠和癌症等高需求条件下，局部组织微环境中和全身性的精氨酸水平可能会受到限制。一些组织和细胞可以通过精氨基琥珀酸合酶(ASS1)和鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的表达从前体重新合成精氨酸来保护自己。缺乏这些酶中至少一种的表达的细胞依赖于细胞外精氨酸的输入，这种状态称为精氨酸营养缺陷。
[0014]在跨细胞膜转运后，精氨酸主要由精氨酸酶1(ARGI)、精氨酸酶II(ARGII)和一氧化氮合酶(NOS)代谢。精氨酸酶1和精氨酸酶2分解代谢精氨酸转化为尿素和鸟氨酸。尽管功能相似，但这两种酶亚型具有显著的差异。精氨酸酶I在6号染色体上编码，具有细胞质定位，并且主要在肝细胞中表达。小鼠模型中的精氨酸酶1敲除是致命的表型，人类中先天本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含靶标结合部分、细胞内信号传导区和精氨酸酶结构域。2.根据权利要求1所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白为嵌合抗原受体(CAR)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的融合靶标结合蛋白，其中所述精氨酸酶结构域包含I型精氨酸酶或其片段或变体。4.根据权利要求3所述的融合靶标结合蛋白，其中所述I型精氨酸酶结构域的片段包含野生型I型精氨酸酶的至少75％的氨基酸序列。5.根据权利要求3所述的融合靶标结合蛋白，其中所述I型精氨酸酶变体与I型精氨酸酶的相应部分具有至少75％的序列同一性。6.根据权利要求1或权利要求2所述的融合靶标结合蛋白，其中所述精氨酸酶结构域包含II型精氨酸酶或其片段或变体。7.根据权利要求6所述的融合靶标结合蛋白，其中所述I型精氨酸酶结构域的片段包含野生型II型精氨酸酶的至少75％的氨基酸序列。8.根据权利要求6所述的融合靶标结合蛋白，其中所述II型精氨酸酶变体与II型精氨酸酶的相应部分具有至少75％的序列同一性。9.根据前述权利要求中任一项所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含选自由以下组成的组的细胞内信号传导区：4
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1BB信号传导区；OX
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40信号传导区；CD28信号传导区；ICOS信号传导区；和CD3δ信号传导区。10.根据前述权利要求中任一项所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含与选自由以下组成的组的至少一种抗原结合的靶标结合结构域：GD2；CD33；间皮素；EGFRvIII；VEGFR2；FAP；EpCam；GPC3；CD133；IL13Ra；EphA2；Muc1；BCMA；CD70；CD123；ROR1；PSMA；CD5；GAP；CEA；PSCA；Her2；和CD19。11.根据前述权利要求中任一项所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含选自由以下组成的组的靶标结合结构域：抗体；抗体片段，例如scFv；抗体或抗体片段的变体；TCR，例如TCRα链或TCRβ链；和适体。12.根据前述权利要求中任一项所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含结合GD2的靶标结合结构域。13.根据权利要求1至11中任一项所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含结合CD33的靶标结合结构域。14.根据权利要求1至11中任一项所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含结合间皮素的靶标结合结构域。15.根据权利要求1至11中任一项所述的融合靶标结合蛋白，所述融合靶标结合蛋白包含结合EGFRvIII的靶标结合结构域。16.一种细胞，所述细胞包含根据前述权利要求中任一项所述的融合靶标结合蛋白。17.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗西斯，
申请(专利权)人：癌症研究技术有限公司，
类型：发明
国别省市：