包含T-细胞受体恒定结构域的蛋白制造技术

本文提供了包含具有一个或多个稳定突变的T

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含T
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细胞受体恒定结构域的蛋白
[0001]本公开涉及包含具有一个或多个稳定突变的T
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细胞受体(TCR)恒定结构域的蛋白、编码此类蛋白的核酸以及制备和使用此类蛋白的方法。
[0002]T细胞受体(TCR)是适应性免疫系统用于识别和消除“非自身”细胞内抗原的工具。这些非自身抗原可以来自病毒感染或来自基因改变。基因改变是异常细胞功能的关键，并可能导致疾病、诸如癌症。TCR以α/β和γ/δ形式存在，它们在结构上相似但在不同的T细胞上表达。α/β TCR在CD8+效应细胞和CD4+辅助T细胞上均表达，并且当与HLA/MHC复合时识别在感染/癌细胞表面上展示的蛋白酶体降解的外来抗原(Davis等人, Nature, 1988. 334(6181): 395
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402; Heemels, 等人, Annu Rev Biochem, 1995. 64: 463
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91)。当在CD8+ T效应细胞上表达时，α/β TCR与I型MHC/肽复合物特异性相互作用，并且这种相互作用诱导T细胞活化和展示可识别的非自身抗原的细胞的消除。
[0003]在结构上，天然α/β TCR的细胞外部分由两条多肽组成：α链和β链，其各自具有膜近端的恒定结构域(Cα或Cβ结构域)和膜远端的可变结构域(Vα或Vβ结构域)。所述恒定和可变结构域各自包括链内二硫键。所述可变结构域含有类似于抗体的互补决定区(CDR)的高度可变环。TCR的CDR3与由MHC(主要组织相容性复合物)呈递的肽相互作用，并且CDR1和CDR2与肽和MHC相互作用。TCR序列的多样性经由连接的可变(V)、多样性(D)、连接(J)和恒定(C)基因的体细胞重排生成；并且这种重排生成令人难以置信的多样性，其使得TCR能够识别由MHC展示的不同肽抗原。
[0004]已经开发了许多方法来利用α/β TCR的精细非自我识别特性用于治疗用途。重组α/β TCR已被转导/转染至大量幼稚T细胞中，作为重定向这些T细胞以靶向肿瘤相关抗原的手段(Riley等人, Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(3):175
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196; Parkhurst, 等人, Clin Cancer Res, 2017. 23(10): 2491
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2505)。或者，使用与结合活化T细胞受体(通常是CD3ε)的scFv融合的TCR的可溶性细胞外区域，已被用于重定向内源性T细胞以靶向肿瘤细胞(Liddy等人, Nat Med, 2012. 18(6): 980
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7)。与依赖于直接识别在细胞表面上的过表达抗原的典型BiTE
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样双特异性抗体(Baeuerle, 等人, Cancer Res, 2009. 69(12): 4941
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4)不同，TCR或TCR
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模拟双特异性体可以识别细胞内和异常肿瘤或病毒抗原的更大子集，且因此具有更广泛的潜在适用性(Liddy等人, Nat Med, 2012. 18(6): 980
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7)。
[0005]然而，TCR组装和表达是有挑战性的(Wilson等人, Curr Opin Struct Biol, 1997. 7(6): 839
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48)。出于研究和治疗目的，生产可溶性α/β TCR的常用方法是通过在大肠杆菌(E. coli)中表达为包涵体，随后再溶解、重折叠/组装/氧化，且最后以相对低的产率纯化(vanBoxel, 等人, J Immunol Methods, 2009. 350(1
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2): 14
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21)。为了简化组装件，一些研究人员已经尝试仅使用单链形式或scTv的TCR的可变结构域区域，如抗体单链Fv (scFv)，用于靶向特定的HLA/肽复合物(Stone等人, Methods Enzymol, 2012. 503: 189
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222)。尽管scFv已经显示不稳定性、聚集和低溶解度的倾向，但scTCR可变结构域通常显示更差的表达和稳定性问题。已做出巨大努力来稳定scVα/Vβ蛋白以用于治疗和诊断用途(Stone等人, Methods Enzymol, 2012. 503: 189
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222)。不幸的是，Vα/Vβ种系的高度多样性(远高于抗体的V
H
/V
L
种系)，使得scVα/Vβ内的每组稳定突变对于单个Vα/Vβ亚基是独特
的，并且不太可能找到在多个TCR之间的通用用途。
[0006]鉴于大多数细胞外蛋白本质上是糖基化且具有复杂的二硫键配对，哺乳动物表达用于产生可溶性TCR。工业抗体生产主要转移至哺乳动物表达系统(Shukla等人, Bioeng Transl Med, 2017. 2(1): 58
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69)。然而，当在通常利用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系统中表达时，与抗体相比时，α/β TCR表达较差，组装可靠性更低。许多新型双特异性抗体形式，包括与可溶性α/β TCR双特异性体相关的形式的那些，可能需要TCR以抗体样水平表达以进行适当的分子组装，这是其生产的障碍。将可溶性TCR与抗体scFv重组融合的双特异性ImmTac部分通常在细菌中表达为不溶性包涵体，以低产率溶解、重折叠和组装(Liddy等人, Nat Med, 2012. 18(6): 980
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7)。此外，这些部分本质上具有快速的血清清除率，因为它们缺乏循环机制。
[0007]需要适合于跨不同TCR通用并具有良好表达和/或组装水平的TCR稳定工程改造。
[0008]本文提供了在TCR恒定结构域(Cα/Cβ结构域)中包含一个或多个稳定突变的蛋白，其增加TCR恒定结构域的解折叠温度并改善TCR的表达和/或组装。本文提供了蛋白，其包含：第一多肽，其包含T细胞受体(TCR)α恒定结构域(Cα)，其包含以下残基中的至少一个：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；或第二多肽，其包含TCRβ恒定结构域(Cβ)，其包含以下残基中的至少一个：位置134处的赖氨酸、位置139处的精氨酸、位置155处的脯氨酸、位置170处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)。
[0009]本文使用的TCR Cα和Cβ结构域中氨基酸残基的编号遵循Kabat编号系统(Kabat, 等人 Sequences of Immunological Interest Vol. 1 第五版 1991 US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH)，如图2中所举例说明。上述基于Kabat编号的TCR Cα残基对应于SEQ ID NO:5或6(Cα)中的以下残基：Kabat编号的位置139对应于SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.蛋白，其包含：第一多肽，其包含含有以下残基中的至少一个的T细胞受体(TCR) α恒定结构域(Cα)：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；和/或第二多肽，其包含含有以下残基中的至少一个的TCR β恒定结构域(Cβ)：位置134 处的赖氨酸、位置139 处的精氨酸、位置155 处的脯氨酸、位置170 处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据 Kabat 编号进行编号)。2.权利要求1的蛋白，其中：所述第一多肽包含Cα，所述Cα包含以下残基中的至少一个：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且所述第二多肽包含Cβ，所述Cβ包含以下残基中的至少一个：位置134 处的赖氨酸、位置139 处的精氨酸、位置155 处的脯氨酸、位置170 处的天冬氨酸或谷氨酸(残基根据 Kabat 编号进行编号)。3.权利要求1或2的蛋白，其中：所述第一多肽包含Cα结构域，所述Cα结构域包含以下残基：位置139处的苯丙氨酸、位置150处的异亮氨酸、位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且所述第二多肽包含Cβ结构域，所述Cβ结构域包含以下残基：位置134 处的赖氨酸、位置139 处的精氨酸、位置155 处的脯氨酸、位置170 处的天冬氨酸(残基根据 Kabat 编号进行编号)。4.权利要求1或2的蛋白，其中：所述第一多肽包含Cα结构域，所述Cα结构域包含以下残基：位置139处的苯丙氨酸和位置190处的苏氨酸(残基根据Kabat编号进行编号)；且所述第二多肽包含Cβ结构域，所述Cβ结构域包含以下残基：位置134 处的赖氨酸、位置139 处的精氨酸、位置155 处的脯氨酸、位置170 处的天冬氨酸(残基根据 Kabat 编号进行编号)。5.权利要求1
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4中任一项的蛋白，其中所述第一多肽通过链间二硫键与所述第二多肽连接。6.权利要求1
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5中任一项的蛋白，其中：所述Cα结构域进一步包含在位置166处的半胱氨酸残基(残基根据Kabat编号进行编号)，且所述Cβ结构域进一步包含在位置173处的半胱氨酸残基(残基根据Kabat编号进行编号)，其中所述第一多肽和所述第二多肽通过Cα的位置166处的半胱氨酸残基和Cβ的位置173处的半胱氨酸残基之间的链间二硫键连接。7.权利要求1
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5中任一项的蛋白，其中：所述Cα结构域包含SEQ ID NO:5；且所述Cβ结构域包含SEQ ID NO:7。8.权利要求1
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5中任一项的蛋白，其中：所述Cα结构域由SEQ ID NO:5组成；且
所述Cβ结构域由SEQ ID NO:7组成。9.权利要求1
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6中任一项的蛋白，其中：所述Cα结构域包含SEQ ID NO:6；且所述Cβ结构域包含SEQ ID NO:8。10.权利要求1
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6中任一项的蛋白，其中：所述Cα结构域由SEQ ID NO:6组成；且所述Cβ结构域由SEQ ID NO:8组成。11.权利要求1
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10中任一项的蛋白，其中：所述第一多肽进一步包含TCRα可变结构域(Vα)；且所述第二多肽进一步包含TCRβ可变结构域(Vβ)，其中所述Vα和Vβ形成结合抗原的抗原结合结构域。12.权利要求11的蛋白，其中：Vα融合至Cα的N
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末端；且Vβ融合至Cβ的N
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末端。13.权利要求11的蛋白，其中所述抗原是肿瘤抗原或病毒抗原。14.权利要求1
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13中任一项的蛋白，其中所述蛋白进一步包含第二抗原结合结构域。15.权利要求14的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域结合T细胞表面上的抗原。16.权利要求14的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域结合CD3。17.权利要求14
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16中任一项的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域是scFv、Fab、Fab'、(Fab')2、单结构域抗体或骆驼科VHH结构域。18.权利要求14
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17中任一项的蛋白，其中所述第二抗原结合结构域是Fab。19.权利要求18的蛋白，其中所述Fab包含Fab重链和Fab轻链，所述Fab重链包含重链可变结构域(VH)和人IgG CH1结构域，所述Fab轻链包含轻链可变结构域(VL)和人轻链恒定结构域(CL)，其中所述VH和VL形成结合CD3的第二抗原结合结构域。20.权利要求18或19的蛋白，其中所述蛋白包含三个多肽：包含Vα
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Cα
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接头
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VH
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CH1的第一多肽；包含Vβ
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Cβ的第二多肽；和包含VL
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CL的第三多肽；其中所述第二和第三多肽通过链间二硫键与所述第一多肽连接。21.权利要求1
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20中任一项的蛋白，其中所述蛋白进一步包含人IgG Fc区(Fc)。22.权利要求21的蛋白，其中所述人IgG Fc区是修饰的人IgG Fc区，其与对应的野生型人IgG Fc区相比具有降低的效应子功能。23.权利要求1
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19、21或22中任一项的蛋白，其中所述蛋白包含四个多肽：包含Vα
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C...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：北卡罗来纳查佩尔山大学，
类型：发明
国别省市：