空间条形码化制造技术

本发明专利技术涉及对基底上的给定位置进行空间条形码化的方法，并且进一步涉及为了分析组织中存在的分子特征的目的而对诸如生物组织样本的样品中存在的检测探针进行空间条形码化。此类分析可以包括：i)一种或多种生物分子的特定空间表达；ii)转录组的空间分析和/或iii)蛋白质组的空间分析，包括翻译后蛋白质修饰。本发明专利技术进一步涉及用于执行此类方法的各种组件产品，包括试剂盒、仪器和软件。仪器和软件。仪器和软件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】空间条形码化


[0001]本专利技术涉及对给定位置进行空间条形码化的方法，并且进一步涉及为了分析组织中存在的分子特征的目的而对样品(例如生物组织样本)中存在的检测探针进行空间条形码化。此类分析可以包括例如以下一项或多项：i)一种或多种生物分子的特定空间表达；ii)转录组的空间分析和/或iii)蛋白质组的空间分析，包括翻译后蛋白质修饰。本专利技术进一步涉及用于执行此类方法的各种组件产品，包括试剂盒、仪器和软件。

技术介绍

[0002]生物分子表达的原位分析是近年来发展迅速的
特别是，原位转录组学和多重组织化学分析技术(其允许确定正在表达什么基因和/或可能存在什么生物标志物，以及在给定组织样品的任何给定位置达到什么水平)的发展已经越来越受欢迎，并启用了全新的生物学研究范围。
[0003]从历史上看，允许以高通量同时测量许多生物分子的方法提供了给定样品中平均表达水平的数据，但没有任何关于分子在哪儿表达的背景。最近，已开发出单细胞分析技术，其中对来自分解组织的细胞进行单独分析。虽然这些方法提供了有关样品中发生的生物过程的更详细信息，并允许识别对它们有贡献的稀有细胞群体，但缺乏真正的空间信息是研究的一个重大障碍。由于所有的生物学都发生在空间中，因此给定的生物分子在一个过程中的功能只能通过考虑分子本身作用的空间背景来完全理解。
[0004]该领域已经开始通过提供各种原位转录组学和蛋白质组学方法(包括基因或蛋白质表达的空间检测手段)来解决对空间信息的需求。还有一系列用于代谢物和其他生物分子的空间分析的方法。这些方法可以大致分为两组；基于图像的方法和无图像的方法。
[0005]在基于图像的基因表达测量方法中，包含在生物组织中的RNA首先与互补序列的DNA探针接触。在一些技术中，探针直接用于通过荧光来检测和鉴定每个RNA分子，其使用多种检测方案，在一些情况下包括通过分支DNA的信号放大、杂交链式反应或滚环扩增。在其他技术中，探针用作RNA逆转录的引物，为每个RNA转录物产生互补的DNA分子，所述DNA分子可以通过原位测序进行扩增和检测。此类方法包括merFISH、seqFISH、starMAP、FISSEQ、ISS和BARISTAseq。在所有这些方法中，多种类型的RNA分子(对应于不同的基因)的识别是通过重复循环的荧光成像实现的，其中单个分子被检测为荧光点。这些方法在实现单分子成像的能力方面受到限制，因为图像信号可能具有低强度、难以区分并且受到自发荧光或背景噪声的影响。此外，这些方法不允许识别非常丰富的RNA分子，因为这些产生在空间上重叠并且无法解码(拥挤)的信号。对于这些技术中的许多而言，重复成像循环的需求也是一个重要问题，因为每个循环的图像需要精确对齐到几纳米的精度，这在技术上具有挑战性。最后，这些方法非常耗时，因为它们需要非常高的放大倍率才能实现单分子分辨率，并且每次只能对非常小的组织区域进行成像。完整实验所需的时间与所分析的组织区域和检测到的特征(基因)数量成比例，这限制了可以恢复的信息量。
[0006]无图像基因表达测量方法避免了对组织样品进行成像的限制，并依靠测序技术来
确定给定RNA分子的位置。这需要将空间DNA条形码与要检测的分子融合，通过使用空间条形码作为逆转录的引物来实现，从而产生空间条形码化的cDNA。这些方法要快得多，因为整体上相对较慢的成像时间被移除并且数据分析更加简单。此类方法包括：10x Visium、SlideSeq和HDST。然而，这些方法的效率较低，并且由于逆转录步骤的限制，通常受限于捕获不超过10％的细胞RNA含量。此外，它们都需要某种固体支持物，在添加样品之前在其上排列空间DNA条形码。这种支持物生产成本高、易碎，并且通常导致空间分辨率低，这不允许从单细胞中捕获信息。此外，空间条形码化不遵循组织的结构，而是空间地址以规则的方形网格或随机排列。这导致部分组织未被分析，并且一些空间条形码与多个细胞重叠，产生不精确的信息。
[0007]原位蛋白质组学方法使用与探针缀合的抗体，所述探针可以是荧光分子、化学聚合物结合的重金属同位素或DNA分子。组织与抗体库接触，从而使多个生物标志物(通常是蛋白质或蛋白质修饰)被抗体结合并与探针连接。这些方法包括CODEX、成像质谱流式(Imaging mass cytometry)、MIBI、4i和Miltenyi MACSima。然后通过质谱法或通过荧光成像(在后一种情况下，通过随后的如上所述用于基因表达测量的成像循环)检测探针。这些方法存在许多与上述基于成像的基因表达测量相同的问题。此外，原位蛋白质组学测量主要作为一类单独的技术存在，并且尚未以高通量方式成功地与基因表达测量相结合，从而允许在同一样品中同时测量数百个基因和蛋白质。相关的无抗体方法可以通过直接质谱成像来测量各种小分子和潜在的肽和蛋白质。
[0008]本专利技术旨在通过提供一种新的无图像原位空间条形码化方法来解决上述问题中的一个或多个，该方法通常可用于对分子信息进行空间条形码化，特别是用于组织样品的转录组或蛋白质组的空间分析，或者用于实际上可以被目的组织中的亲和试剂识别的任何分子或特征。
[0009]本专利技术的方法是基于一种利用光作为工具，引导空间条形码在分子上组装，从而通过高通量测序来识别每个分子的原始空间位置，从而将空间条形码编码到核酸分子的技术。
[0010]有利地，本专利技术的方法使用简单的常用仪器，例如光学显微镜和标准组织载玻片，以提供一种在空间上标记组织区域(小到单细胞或亚细胞区室)内的生物分子的方法，具有等于或低于紫外光的衍射极限的分辨率，效率高，并且没有许多与单分子成像相关的问题。该方法能够使用高通量测序单独或同时在同一样品中对基因、蛋白质和其他生物标志物进行定量和空间定位。该方法具有单分子灵敏度、高通量，并产生可以使用该领域可用技术轻松分析的数据，并且进一步结合了允许控制一些重要错误来源(例如脱靶探针结合和背景噪声)的特征。因此，本专利技术的方法比现有方法更便宜、更快和更强大(由于更高的灵敏度、同时分析基因表达和蛋白质/标志物表达的可能性以及易于分析)，同时仍然提取关于组织的分子构成的详细空间信息。

技术实现思路

[0011]根据本专利技术的第一方面，提供了一种对基底的一个或多个位置进行空间条形码化的方法，其包括：
[0012](a)将一个或多个根核酸分子(root nucleic acid molecule)与将在其上构建空
间条形码的所述或每个位置结合，其中所述或每个根分子可以包含光可裂解基团；
[0013](b)任选地，如果所述或每个根分子不包含光可裂解基团，则向所述或每个根分子添加光可裂解基团；
[0014](c)照射基底上待空间条形码化的目的位置，其中照射裂解或改变所述位置内存在的所述或每个根分子的光可裂解基团；
[0015](d)将索引序列添加到步骤(b)中照射的位置内的所述或每个根分子，其中所述索引序列包含光可裂解基团；
[0016](e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对基底的一个或多个位置进行空间条形码化的方法，其包括：(a)将一个或多个根核酸分子与将在其上构建空间条形码的所述或每个位置结合，其中所述或每个根分子可以包含光可裂解基团；(b)任选地，如果所述或每个根分子不包含光可裂解基团，则向所述或每个根分子添加光可裂解基团；(c)照射基底上待空间条形码化的目的位置，其中照射裂解或改变存在于所述位置内的所述或每个根分子的光可裂解基团；(d)将索引序列添加到步骤(b)中照射的位置内的所述或每个根分子，其中所述索引序列包含光可裂解基团；(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到所述位置内的所述或每个根分子的空间条形码。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基底是惰性的或活性的，优选地，所述基底是活性的，优选地，所述基底是组织。3.一种对一种或多种检测探针进行空间条形码化的方法，其包括：(a)为组织提供与一种或多种目的生物分子结合的一种或多种检测探针，其中所述或每种检测探针可以包含光可裂解基团；(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中所述照射裂解或改变所述区域内的所述或每种检测探针的光可裂解基团；(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到所述目的区域内的所述或每种检测探针的空间条形码。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种生物分子选自：核酸、蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸和药物。5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述一种或多种检测探针包含结合区以与生物分子结合，优选地，所述结合区可以是适体、核酸、核酸模拟物、蛋白质或其混合物。6.一种分析组织中的一种或多种转录物的方法，其包括：(a)使所述组织与一种或多种检测探针接触以允许所述或每种检测探针与目的转录物结合，其中所述或每种检测探针包含光可裂解基团；(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中所述照射裂解或改变所述区域内的所述或每种检测探针的光可裂解基团；(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到所述目的区域内的所述或每种检测探针的空间条形码；
(f)对步骤(d)的一种或多种空间条形码化的检测探针或其衍生物进行测序。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述转录物是RNA，优选mRNA。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述或每种检测探针与目的转录物的polyA区结合。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括延长所述或每种检测探针的步骤，优选在3
’
端，优选通过逆转录。10.根据权利要求9所述的方法，其中延长步骤发生在步骤(a)和(b)之间。11.根据权利要求6
‑
10中任一项所述的方法，其中所述或每种检测探针包含结合区，其中所述结合区是核酸或核酸模拟物。12.一种分析组织内的一种或多种标志物的方法，其包括：(a)使所述组织与一种或多种检测探针接触以允许所述或每种检测探针与目的标志物结合，其中所述或每种检测探针包含光可裂解基团；(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中所述照射裂解或改变所述区域内的所述或每种检测探针的光可裂解基团；(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到所述目的区域内的所述或每种检测探针的空间条形码；(f)对步骤(d)的一种或多种空间条形码化的检测探针或其衍生物进行测序。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述或每种标志物是生物分子，优选选自：蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述或每种标志物是蛋白质，并且所述方法是分析组织中的一种或多种蛋白质的方法。15.根据权利要求12
‑
14所述的方法，其中所述或每种检测探针包含结合区，优选地其中所述结合区是蛋白质、适体、核酸、核酸模拟物或其混合物，优选地其中所述结合区是抗体或纳米抗体。16.一种分析组织中的一种或多种转录物和一种或多种标志物的方法，其包括：(a)使所述组织与多种检测探针接触以允许所述检测探针与所述组织中的目的核酸和标志物结合，其中所述或每种检测探针包含光可裂解基团；(b)任选地，如果所述或每种检测探针不包含光可裂解基团，则向所述或每种检测探针添加光可裂解基团；(c)照射组织内待空间条形码化的目的区域，其中所述照射裂解或改变所述区域内的所述或每种检测探针的光可裂解基团；(d)将空间条形码的索引序列添加到步骤(b)中照射的区域内的所述或每种检测探针，其中所述索引序列包含光可裂解基团；(e)重复步骤(c)和(d)，直到添加所需的索引序列以形成连接到所述目的区域内的所述或每种检测探针的空间条形码；
(f)对步骤(d)的一种或多种空间条形码化的检测探针或其衍生物进行测序。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种标志物选自：蛋白质、翻译后蛋白质修饰、代谢物、生物活性小分子、核苷酸或药物，优选地，所述一种或多种标志物是蛋白质。18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述多种检测探针包括：包含结合区为核酸、核酸模拟物或适体的一种或多种检测探针，以及包含结合区为蛋白质的一种或多种检测探针，优选地，蛋白质结合区为抗体或纳米抗体。19.根据权利要求1
‑
18中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前将独特的空间条形码分配给每个目的位置或区域的步骤。20.根据权利要求1
‑
19中任一项所述的方法，其中所述目的位置或区域可以是二维或三维区域，优选是三维区域。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述三维区域的尺寸在1μm3‑
150mm3之间、在1μm3‑
1 mm3之间、在1μm3‑
1,000,000μm3之间、在1μm3‑
200,000μm3之间、在1μm3之间
‑
20,000μm3之间或在1μm3‑
1000μm3之间。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目的区域或位置包括细胞的集合，优选从1到100,000,000个细胞、1,000,000个细胞、1000个细胞、100个细胞、10个细胞，优选地，所述目的区域或位置包括单细胞或亚细胞区域或区室。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括选择一个或多个目的位置或区域的步骤，优选地，选择多个目的位置或区域，优选在步骤(a)之前。24.根据权利要求3
‑
11或16
‑
23中任一项所述的方法，其中所述生物分子是核酸，并且其中所述方法进一步包括预扩增的步骤，优选预扩增目的核酸或目的转录物，优选在步骤(a)之前。25.根据权利要求3
‑
11或16
‑
24中任一项所述的方法，其中所述生物分子是核酸，并且其中所述方法的步骤(a)可以包括使所述组织与...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷戈里，
申请(专利权)人：癌症研究技术有限公司，
类型：发明
国别省市：