一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，包括变性剂、螯合剂、pH缓冲剂、渗透压调节剂和还原剂；所述变性剂包括胍盐和表面活性剂；本发明专利技术还另外提供一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液的制备方法，制备上述一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，包括以下步骤：将各组分配比混合，用pH缓冲剂调节pH，用去离子水定容；过滤，即得到所述保存液。本发明专利技术保存液可在室温条件下，稳定保存粪便样本中人源细胞DNA和病毒RNA至少7天，利于常温远距离运输；同时本发明专利技术保存液还释放核酸，灭活病毒，以免生物外泄发生感染现象；保存液中的去抑制剂成分，可直接与粪便中多种抑制物结合沉淀，减少了对核酸检测的干扰。核酸检测的干扰。核酸检测的干扰。

【技术实现步骤摘要】
一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液及其制备方法。

技术介绍

[0002]越来越多的文献报道新冠病毒核酸RNA在粪便中被检测出，是除口腔拭子样本之外的第二检测途径的新冠病毒样本来源，同时文献报道新冠病毒传播存在粪
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口传播的可能性，美国斯坦福大学的研究人员指出感染新冠病毒7个月后，粪便中仍含有病毒遗传物质。另外诺如病毒也是粪便中一种具有传染性的RNA病毒，有媒体报道指出，在我国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒的检测率为15％左右，诺如病毒是一种引起非细菌性急性胃肠炎的病毒，传染性强、易变异并有相对较短的潜伏期。
[0003]但有时RNA病毒无法从口腔和鼻咽处检出，例如诺如病毒，其最佳检测样本为粪便。因此有时候需要对粪便中病毒核酸进行保存和提取，以增加检测准确性、灵敏度和科学性。然而，粪便离体后，由于所处环境发生了剧烈变化，肠道无氧环境变为空气有氧环境，大量严格厌氧型微生物细胞裂解，细胞死亡后释放大量核酸酶，蛋白酶，使得粪便样本中病毒RNA 极易受到破坏和降解，以及粪便样本中成分复杂，如胆盐，胆色素，胃肠道消化液，纤维，蛋白质等，极大的增加了粪便病毒核酸的保存与提取难度。现有技术无法长时间保存粪便中病毒核酸RNA，且运输过程需要采用低温运输，否则粪便中病毒核酸RNA极容易降解。因此，迫切需要开发一种能够在常温条件下，长时间保存粪便样本中病毒RNA的核酸保存溶液。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术期望提供一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液及其制备方法，在常温下与粪便样本混合后，能够迅速裂解粪便中的人源细胞和病毒，灭活核酸酶和蛋白酶，避免细菌和病毒外泄导致感染，同时保存液与粪便样本中的各种抑制物形成沉淀，保护核酸，提高核酸提取效率，可在常温下长时间保存粪便样本中病毒RNA，使其维持稳定状态，避免了送检运输过程中的降解风险。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，包括变性剂、螯合剂、pH缓冲剂、渗透压调节剂和还原剂；所述变性剂包括胍盐和表面活性剂。
[0007]这里，所述变性剂直接裂解细胞以及病毒并释放核酸，同时灭活病毒，以避免生物外泄发生感染现象；且所述保存液能够稳定保存粪便样本中人源细胞DNA和病毒RNA至少7天，防止核酸降解，利于样本常温远距离运输。
[0008]进一步地，所述胍盐为盐酸胍、磷酸胍、聚六亚甲基双胍、异硫氰酸胍中的一种或两种以上的组合物；所述胍盐的含量为2～8M。
[0009]进一步地，所述表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠、SDS、Triton X
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100、十六烷基三
甲基溴化铵中的一种或两种以上的组合物；所述表面活性剂的含量为0.2～0.6M。
[0010]进一步地，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠、磷酸钠、二乙基三胺五乙酸中的一种或两种以上的组合物；所述螯合剂的含量为0.1～1M。
[0011]进一步地，所述保存液的pH为7.0～12.0；所述pH缓冲剂为柠檬酸缓冲剂或磷酸缓冲剂；所述pH缓冲剂的含量为0.2％～0.8％。
[0012]进一步地，所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁中的一种或两种以上的组合物；所述渗透压调节剂的含量为3％～8％。
[0013]进一步地，所述还原剂为DTT、TCEP、β
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巯基乙醇中的一种或两种以上的组合物；所述还原剂的含量为3～7mM。
[0014]这里，按粪便样本RNA病毒核酸保存液的总量计算各组分含量；上述螯合剂、渗透压调节剂、还原剂均为去抑制剂成分，直接与粪便中多种抑制物结合沉淀，简化了下游核酸提取程序，也减少了对核酸检测的干扰。
[0015]本专利技术还提供一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液的用途，使用上述一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，保持粪便样本中的RNA病毒核酸以及人源核酸的稳定；和/或灭活粪便样本中的病毒、微生物并释放核酸。
[0016]进一步地，所述粪便样本来源于人或非人动物；所述粪便样本与保存液的质量体积比为1:10。
[0017]这里，所述人源核酸包括肠道微生物DNA和宿主人源肠道脱落细胞 DNA。
[0018]本专利技术还另外提供一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液的制备方法，制备上述一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，包括以下步骤：
[0019]1)将各组分配比混合，用pH缓冲剂调节pH，用去离子水定容；
[0020]2)过滤，即得到所述保存液。
[0021]本专利技术有益效果如下：1)本专利技术保存液可在室温条件下，稳定保存粪便样本中人源细胞DNA和病毒RNA至少7天，利于样本转运至第三方检测机构进行病毒检测；2)本专利技术保存液是一种裂解型保存液，可直接裂解细胞以及病毒并释放核酸，同时灭活病毒，以避免生物外泄发生感染现象；
[0022]3)本专利技术保存液采用去抑制剂成分，直接与粪便中多种抑制物结合沉淀，简化了下游核酸提取程序，也减少对核酸检测的干扰。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例2中粪便保存液中人源DNA荧光定量曲线图；
[0024]图2为本专利技术实施例3中粪便保存液中IBV病毒RNA荧光定量曲线图；
[0025]图3为本专利技术实施例3中不同时期粪便保存液中病毒核酸荧光定量曲线图；
[0026]图4为本专利技术实施例4中A公司保存液提取的核酸原液与10倍稀释样本荧光定量曲线图；
[0027]图5为本专利技术实施例4中2号保存液提取的核酸原液与10倍稀释样本荧光定量曲线图。
具体实施方式
[0028]为了能够更加详尽地了解本专利技术的特点与
技术实现思路
，下面结合附图对本专利技术的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本专利技术。
[0029]实施例1粪便保存液配方
[0030]本实施例一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，包括2～8M的异硫氰酸胍、0.2～0.6M的十六烷基三甲基溴化铵，0.1～1M的乙二胺四乙酸二钠， 0.2％～0.8％的柠檬酸缓冲剂，3％～8％的氯化钠和3～7mM的DTT，pH值为 7.5～9.5。
[0031]在上述配方浓度范围内，分别配置1～3号保存液，具体配方如表1所示。
[0032]表1粪便保存液配方
[0033]组分终浓度1号保存液2号保存液3号保存液异硫氰酸胍2～8M2M4M6M十六烷基三甲基溴化铵0.2～0.6M0.3M0.4M0.5M乙二胺四乙酸二钠0.1～1M0.3M0.6M0.9M柠檬酸缓冲剂0.2％～0.8％0.3％0.5％0.7％氯化钠3～8％2％5％8％DTT3～7mM3mM4mM5mM
[0034]实施例2RNA病毒核酸保存液保存粪便中人源DNA稳定性性能研究
[0035]取样：由3名不同志愿者提供粪便样本，分别将1克左右新鲜粪便，置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，其特征在于，包括变性剂、螯合剂、pH缓冲剂、渗透压调节剂和还原剂；所述变性剂包括胍盐和表面活性剂。2.根据权利要求1所述的一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，其特征在于，所述胍盐为盐酸胍、磷酸胍、聚六亚甲基双胍、异硫氰酸胍中的一种或两种以上的组合物；所述胍盐的含量为2～8M。3.根据权利要求1所述的一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠、SDS、Triton X
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100、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或两种以上的组合物；所述表面活性剂的含量为0.2～0.6M。4.根据权利要求1所述的一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，其特征在于，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠、磷酸钠、二乙基三胺五乙酸中的一种或两种以上的组合物；所述螯合剂的含量为0.1～1M。5.根据权利要求1所述的一种粪便样本中RNA病毒核酸保存液，其特征在于，所述保存液的pH为7.0～12.0；所述pH缓冲剂为柠檬酸缓冲剂或磷酸缓冲剂；所述pH缓冲剂的含量为0.2％～0.8％。6.根据权利要求1所述的一种粪...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗享，殷剑峰，王春香，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：