一种用于生物制品外源性DNA残留量的检测方法及其样本的处理方法技术

本发明专利技术公开了一种用于生物制品外源性DNA残留量的检测方法及其样本的处理方法，采用优化后的磁珠法对生物制品外源性DNA进行提取和纯化，提取得到DNA提取液，并非用于qPCR检测，而是采用荧光染色检测方法，具有高回收率、高灵敏度、可操作性强、成本低、效率高等特点。效率高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生物制品外源性DNA残留量的检测方法及其样本的处理方法


[0001]本专利技术属于生物医药检测
，具体的说，是一种用于生物制品外源性DNA残留量的检测方法及其样本的处理方法。

技术介绍

[0002]我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA的含量进行限制。酵母、大肠杆菌表达的生物制品限定不超过10ng/剂，CHO和vero细胞表达的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超过100或10pg/剂。2010年版中国药典附录收录了DNA探针杂交法和荧光染料法作为残余DNA检测方法。以地高辛标记斑点杂交法为代表的DNA杂交法因为操作复杂，耗时较长，且只能半定量，在2014年美国药典修订版征询意见稿中已经被剔除。我国2010版药典及2015版药典（附录IX B 外源性DNA残留量测定法）的征求意见稿中收载了DNA探针杂交法和荧光染料法，而2009年美国USP就收录了杂交法、阈值法和qPCR法，到2015年底USP将只收录高灵敏度、高特异性的qPCR法作为残留DNA检测的推荐方法。由此可见qPCR法将成为国际公认的残留DNA检测方法，也可能会是我国下一版药典的主要修订内容。国内生物制品研发与生产企业，以及生产纯化填料的上下游企业，尽早建立以qPCR方法为基础的宿主残余DNA检测体系，将有利于改进工艺、提高产品质量，实现与欧美发达国家生物药品标准的接轨。但由于qPCR法需要昂贵的实验仪器（实时荧光定量PCR仪）及微量的实验反应体系，对于大多数创业公司来讲，其人员资质及企业财力均不能满足要求，故对于该方法的标准化操作目前仍难以实现。
[0003]公开号为CN10909745A的专利技术专利公开了一种HEK293 gDNA残留量的检测方法，该方法包括样品前处理和HEK293 gDNA残留量的定量PCR检测，具有高效、快速、准确、特异性强的优点。在样品前处理时，首先利用细胞裂解液和蛋白酶K对样品进行消化处理，然后再加入异丙醇和磁珠对核酸进行抽提富集，并洗涤两次以去除蛋白及其它污染，最后将核酸从磁珠上洗脱以用于后续定量检测，核酸的回收率在70%以上，可提高后续定量分析的准确性。
[0004]公开号为CN103031300A的专利技术专利公开了一种从重组蛋白制品中提取残留DNA的磁珠法。该方法适用于生物制品制备过程的中间体和原液中残留DNA的提取，可用于监测纯化工艺去除外源DNA的能力，采用样品制备、酶切、DNA结合、DNA清洗和DNA洗脱等步骤对样品中的DNA进行提取，与常规方法相比，即使痕量DNA（＜1pg），该方法能将DNA回收率稳定在70%至130%之间。
[0005]基于上述情况，我们发现，在对生物制品外源性DNA残留量进行检测时，还存在以下问题：（1）样品经提取纯化后仍然使用PCR定量检测，目前中检院E.coli 宿主细胞DNA定量检测试剂盒（PCR
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荧光探针法）的售价为18000RMB/盒，检测成本高。
[0006]（2）现有磁珠法在对样品中的残留DNA进行提取时，还存在操作步骤繁杂、可操作
性能差等缺陷，例如：使用高速离心机反复离心，不仅步骤繁琐，离心提取时还容易使DNA产生气溶胶，对试验室的环境造成污染；使用水浴加热设备，也易产生废弃污水，等等。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在解决现有生物制品外源性DNA检测方法存在的弊端，提供了一种用于生物制品外源性DNA残留量的荧光染色检测方法，避免采用PCR定量检测，以大幅度降低检测成本。由于目前的荧光染色检测法采用直接向待检样品中添加荧光染料进行检测，针对于不同样品其样品组成对实验的荧光标记反应势必会造成不同程度的干扰，因此，本专利技术还提供了一种专门针对生物制品外源性DNA残留量的荧光染色检测的样品处理方法，即对生物制品外源性DNA进行提取纯化后再进行荧光染色检测，并非用于qPCR检测。现有技术中虽然提供了在PCR定量检测前可以采用磁珠法对待测样品进行提取，但现有磁珠法仍然存在很多弊端，操作性能差，对实验环境也并不友好，同时，在用于荧光染色检测时，为使荧光染色检测方法更加准确，应尽可能的排除样品本身的干扰，因此，本专利技术较现有磁珠提取法而言，对DNA提取液的纯化尤为重要。
[0008]本专利技术通过下述技术方案实现：一种用于生物制品外源性DNA残留量检测的样本处理方法，包括以下步骤：A.分别制备蛋白酶K工作液、磁珠结合液、清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，备用；B.在待检样品中加入蛋白酶K工作液，混匀后，放入恒温震荡金属浴中孵育；C.孵育结束后放冷至室温，再加入磁珠结合液，混匀后，加入羟基氧化硅磁珠，混匀后，置于磁分离器上进行磁分离，并吸去废液；D.加入清洗缓冲液A，混匀后，置于磁分离器上进行磁分离，吸去废液；再加入清洗缓冲液B，混匀后，置于磁分离器上进行磁分离，吸去废液；再加入清洗缓冲液B重复清洗一次；E.清洗后经室温晾干，加入TE Buffer重悬磁珠，放入恒温震荡金属浴中孵育；F.孵育后置于磁分离器上进行磁分离，吸出得到的液体，即DNA提取液。
[0009]所述步骤A中，制备蛋白酶K工作液的步骤包括：a.分别制备浓度为1 mol/L的Tris
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HCl 缓冲液、浓度为0.5mol/L 的EDTA
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Na2溶液和浓度为100mmol/L的CaCl2溶液，备用；b.取5ml 1mol/L 的Tris
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HCl 缓冲液与1ml 0.5mol/L的EDTA
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Na2溶液，加水至500ml并混合均匀，在121℃下灭菌20min，制备得到TE缓冲液，并于2~8℃下保存，备用；c.取90ml的TE缓冲液与10ml 100mmol/L 的CaCl2溶液混合均匀后，制备得到蛋白酶K缓冲液，并于2~8℃下保存，备用；d.将蛋白酶K粉末溶解于水中，制备得到浓度为20mg/ml的蛋白酶K浓缩液，并于
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20℃下保存，备用；e. 将20mg/ml的蛋白酶K浓缩液用蛋白酶K缓冲液稀释20倍，制得所述蛋白酶K工作液。
[0010]所述步骤A中，制备磁珠结合液的步骤包括：a.将盐酸胍用水溶解后，再用氢氧化钠溶液调pH值至4.9，制备得到浓度为5mol/L的盐酸胍缓冲液，并于2~8℃下保存，备用；
b.将无水异丙醇与5mol/L的盐酸胍缓冲液按体积比3：2混合，制得所述磁珠结合液，并于2~8℃下保存。
[0011]所述步骤A中，制备清洗缓冲液A的步骤包括：a.将盐酸胍用水溶解后，再用氢氧化钠溶液调pH值至7.5，制备得到浓度为60mmol/L的盐酸胍缓冲液，并于2~8℃下保存，备用；b.将无水乙醇与60mmol/L的盐酸胍缓冲液按体积比3：2混合，制得所述清洗缓冲液A，并于2~8℃下保存，制备清洗缓冲液B的步骤包括：取无水乙醇80ml，加水至100ml，并于2~8℃下保存。
[0012]所述步骤B中，向2.0ml EP管中加入500μl待检样品后，再加入50μl蛋白酶K工作液，涡旋混匀5秒后，在恒温震荡金属浴中以6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于生物制品外源性DNA残留量检测的样本处理方法，其特征在于：包括以下步骤：A.分别制备蛋白酶K工作液、磁珠结合液、清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，备用；B.在待检样品中加入蛋白酶K工作液，混匀后，放入恒温震荡金属浴中孵育；C.孵育结束后放冷至室温，再加入磁珠结合液，混匀后，加入羟基氧化硅磁珠，混匀后，置于磁分离器上进行磁分离，并吸去废液；D.加入清洗缓冲液A，混匀后，置于磁分离器上进行磁分离，吸去废液；再加入清洗缓冲液B，混匀后，置于磁分离器上进行磁分离，吸去废液；再加入清洗缓冲液B重复清洗一次；E.清洗后经室温晾干，加入TE Buffer重悬磁珠，放入恒温震荡金属浴中孵育；F.孵育后置于磁分离器上进行磁分离，吸出得到的液体，即DNA提取液。2.根据权利要求1所述的一种用于生物制品外源性DNA残留量检测的样本处理方法，其特征在于：所述步骤A中，制备蛋白酶K工作液的步骤包括：a.分别制备浓度为1 mol/L的Tris
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HCl 缓冲液、浓度为0.5mol/L 的EDTA
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Na2溶液和浓度为100mmol/L的CaCl2溶液，备用；b.取5ml 1mol/L 的Tris
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HCl 缓冲液与1ml 0.5mol/L的EDTA
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Na2溶液，加水至500ml并混合均匀，在121℃下灭菌20min，制备得到TE缓冲液，并于2~8℃下保存，备用；c.取90ml的TE缓冲液与10ml 100mmol/L 的CaCl2溶液混合均匀后，制备得到蛋白酶K缓冲液，并于2~8℃下保存，备用；d.将蛋白酶K粉末溶解于水中，制备得到浓度为20mg/ml的蛋白酶K浓缩液，并于
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20℃下保存，备用；e. 将20mg/ml的蛋白酶K浓缩液用蛋白酶K缓冲液稀释20倍，制得所述蛋白酶K工作液。3.根据权利要求1所述的一种用于生物制品外源性DNA残留量检测的样本处理方法，其特征在于：所述步骤A中，制备磁珠结合液的步骤包括：a.将盐酸胍用水溶解后，再用氢氧化钠溶液调pH值至4.9，制备得到浓度为5mol/L的盐酸胍缓冲液，并于2~8℃下保存，备用；b.将无水异丙醇与5mol/L的盐酸胍缓冲液按体积比3：2混合，制得所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国庆，任昭源，陈山岭，张开俊，
申请(专利权)人：成都可恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：