一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用，采用EAST6和CFP10两种蛋白组成，具有EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE的六种连接结构，可用于制备MTB感染及NTM感染的各类诊断或辅助诊断产品，并具备较高的灵敏度和特异性。异性。异性。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术是一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用，具体涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE及其制备方法和应用，属于生物


技术介绍

[0002]结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染发病，俗称结核病，是一种慢性传染性疾病。根据2020年10月，WHO发布的《2020年全球结核病报告》：2019年，全球估算新发结核病患者996万例，其中成年男性554万例，成年女性322万例；0~14岁儿童119万例，较去年增长7万例，其中男童和女童分别为62.4万和57万。居前三位的印度（264万）、印度尼西亚（84.5万）和中国（83.3万）估算新发结核病患者总数占全球估算发病总数近一半。2019年全球估算结核病死亡例数141万，其中HIV阳性患者为20.8万，HIV阴性患者为121万。自2007年结核病持续位列全球十大死因之一，并为传染病中的头号杀手。
[0003]MTB感染主要以潜伏状态存在，其中5%~10%潜伏感染者会在其一生中发展成活动性结核病患者。根据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，国内MTB感染潜伏患者约为5.5亿人，占全国总人数的45%，平均每年新发结核病患者100万例。若能对MTB潜伏感染者进行早期预防性治疗，就能够大大降低其发展成活动性结核病患者的机率，有效控制结核病的传播。因此，对潜伏感染者的筛查就显得尤为重要。
[0004]MTB感染临床诊断方法较多，但均不能达到早期、有效、特异的诊断目的：痰涂片的检出率太低，痰培养时间太长；影像学（胸部X光、CT等）难以做到早期发现及大规模普筛；免疫学诊断虽然简单、快速、灵敏而有较好发展前景，但仍缺乏特异性抗原。现在对于MTB的筛查主要有二种方法：结核菌素纯蛋白衍生物的皮肤试验（TB
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PPD法）和γ
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干扰素释放试验（IGRAs法）。TB
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PPD法是经典方法，皮试操作方便易行，是我国MTB筛查最广泛的方法。然而，TB
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PPD法虽已用于大规模普筛，但其包含有分枝杆菌属（MTB和NTM）的大多数共有抗原，使得诊断的特异性较差，无法区分卡介苗接种、MTB和NTM感染，假阳性较高。IGRAs法为WHO推荐的方法，通过MTB特异性抗原刺激淋巴细胞释放γ干扰素来检测是否为MTB感染的检查方法。阳性表明既往曾感染MTB，可排除卡介苗接种及大部分NTM感染，所需时间也较短，但价格昂贵，不适合大规模筛查。
[0005]近年来，利用特异性MTB抗原制备新型皮试试剂，已经成为全球结核病防控研究的热点。其中ESAT
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6蛋白是一种低分子量的早期分泌蛋白，ESAT
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6基因存在于MTB中，因此，ESAT
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6对MTB感染者具有高度特异性。ESAT
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6蛋白可刺激MTB感染者产生T细胞免疫应答并释放多种细胞因子（白细胞介素
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2、γ
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干扰素、肿瘤坏死因子等），进而诱导机体发生迟发型超敏反应（DTH）。此反应强度与细胞免疫应答呈正相关，反应越强，表示MTB感染的可能性越大，可作为MTB感染的诊断方法。ESAT
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6在MTB增值期和非增值期都能高水平转录，因此，无论是活动性结核病患者还是MTB潜伏感染者，ESAT
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6都能有效诱导机体产生细胞免疫应答。CFP
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10蛋白与ESAT
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6蛋白相似，也是一种早期分泌小分子蛋白，通常与ESAT
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6蛋白形成异源二聚体，同样具有高度特异性，能诱导机体产生细胞免疫反应。
[0006]根据前人研究，在结核病体外诊断及皮肤试验中，联用两种以上抗原的诊断特异性及灵敏度均好于单一抗原，能大幅降低注射剂量，提高安全性。在生产成本方面，融合蛋白解决了小分子蛋白不易纯化的难题。在操作方面，皮肤试验简便易行，对MTB感染的大规模筛查提供很好的选项。例如：公开号为CN110423279A的专利技术专利公开的一种结核分枝菌融合蛋白EECC，采用顺次连接EAST6
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EAST6
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CFP10
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CFP10组成蛋白融合。在进行结核病诊断时，在保证较高特异性的同时具有较好的灵敏度，可有效降低使用剂量，降低检测成本，有效区分结核菌活菌感染、死菌致敏、BCG接种，可用于结核病诊断、结核病疫苗制备、抗原特异的细胞因子的检测。以及公开号为CN110684116A的专利技术专利还公开的一种结核分枝杆菌EEC融合蛋白，采用顺次连接EAST6
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EAST6
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CFP10组成蛋白融合。同样具有较高的特异性和灵敏度，也可有效区分结核菌活菌感染、死菌致敏、BCG接种，可用于未感染结核杆菌人群、结核感染人群的诊断和治疗。
[0007]非结核分枝杆菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）是指除结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。其特性有别于结核分枝杆菌，如对酸、碱比较敏感；生长温度不如结核分枝杆菌严格；多存在于环境中；为条件致病菌。因可引起结核样病变而受到关注，常见咳嗽、疲乏，病情较重者有发热、体重减轻、咯血和气促，有基础病者临床症状恶化等表现。其抗原与MTB有交叉。NTM还有一个重要特点，就是对常用的抗MTB的药物耐药，需要用其他治疗方案治疗。因此，如何区分MTB感染和NTM感染同样显得十分重要。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种含有结核分枝杆菌融合蛋白的产品，结核分枝杆菌融合蛋白采用EAST6和CFP10两种蛋白组成，具有EEC、ECE、CEE、ECC、CEC和CCE的六种连接结构，可用于制备MTB感染及NTM感染的各类诊断或辅助诊断疫苗，并具备较高的灵敏度和特异性。
[0009]本专利技术通过下述技术方案实现：一种结核分枝杆菌融合蛋白在制备用于诊断或辅助诊断结核分支杆菌感染、非结核分支杆菌感染产品中的应用，所述结核分枝杆菌融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的融合蛋白EEC、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的融合蛋白ECE、氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的融合蛋白CEE、氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的融合蛋白ECC、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的融合蛋白CEC或氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的融合蛋白CCE中的一种，所述结核分枝杆菌融合蛋白满足以下产品指标：纯度≥95%；分子量为30.6kD
±
3.1kD；等电点主区带为3.8~4.8；紫外光谱最大吸收峰波长为280nm
±
3nm；N端氨基酸序列为(Met)
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Gly
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Thr
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种结核分枝杆菌融合蛋白在制备用于诊断或辅助诊断结核分支杆菌感染、非结核分支杆菌感染产品中的应用，其特征在于：所述结核分枝杆菌融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的融合蛋白EEC、氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的融合蛋白ECE、氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的融合蛋白CEE、氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的融合蛋白ECC、氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的融合蛋白CEC或氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示的融合蛋白CCE中的一种，所述结核分枝杆菌融合蛋白满足以下产品指标：纯度≥95%；分子量为30.6kD
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3.1kD；等电点主区带为3.8~4.8；紫外光谱最大吸收峰波长为280nm
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3nm；N端氨基酸序列为(Met)
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Asp
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Leu
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Gln
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Glu
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Ala
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Gly；外源性DNA残留量≤10ng/ml；宿主菌蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：张开俊，李丙超，付青松，沈尹琪，任昭源，
申请(专利权)人：成都可恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：