一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法。首先，靶标miRNA

【技术实现步骤摘要】
一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种基于点击化学末端脱氧核苷酸转移酶结合CRISPR/Cas12a对miRNA的检测方法。

技术介绍

[0002]MiRNA是一类具有高保守、小分子量(18
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25nt)的非编码内源性单链RNA，广泛存在于人类遗传基因组中。一些miRNAs与多种疾病密切相关，如精神疾病、心血管疾病和肿瘤的发生。MiRNAs可以与特定的靶基因结合，调控下游靶基因的转录和翻译，并在各种疾病中发挥不同的作用。例如，miRNA
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21作为一种致癌基因，可能成为各种疾病和癌症诊断的生物标志物和治疗靶点。许多传统的miRNAs检测策略(RNA印迹、微阵列、实时定量PCR)已经得到了广泛的应用。RNA印迹是一种常用的miRNAs检测方法，但该方法通量低，灵敏度低，使用时间长，消耗大量样品。微阵列技术对多种miRNAs的高通量分析尤其有效，但其灵敏度和选择性较低。与上述两种方法相比，实时荧光定量PCR(qRT
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PCR)具有较高的灵敏度、准确性和实用性，是目前基因定量表达的金标准。该方法往往存在分析复杂、成本高、通量低的问题。
[0003]聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)为分子诊断建立了新的途径。CRISPR/Cas12任意切割非目标核酸(称为反式核酸活性)后，其已经显示出作为一种生物传感器的巨大潜力。由于CRISPR/Cas12a系统具有固有的高分辨率、简单性和自我信号放大能力，因此为miRNA检测方法提供了新的机会。许多基于CRISPR/Cas12a的生物传感器与交链反应(HCR)、催化发夹组装(CHA)、滚动循环转录(RCT)和链置换扩增等核酸等温扩增技术相结合去提高miRNAs检测的灵敏度。HCR电路作为一个信号传感器，将每个miRNA转化为多个可编程的DNA双链，激活CRISPR/Cas12a的反式裂解活性。基于CRISPR/Cas12a结合HCR开发了一种简单、通用的miRNA检测平台。利用模块化CHA将靶miRNA转化并扩增为多个可编程DNA双链，启动CRISPR/Cas12a的反式切割能力。通过将CRISPR/Cas12a和CHA电路结合，建立了一种用于miRNAs扩增检测的通用传感系统。靶miRNA特异性地启动CHA，然后激活被阻断的crRNA变为前体crRNA进行CRISPR/Cas12a加工，从而产生成熟地crRNA引导CRISPR/Cas12a识别激活剂和解锁CRISPR/Cas12a的反式裂解能力。Chen等人通过将基于RNA的CHA电路与CRISPR/Cas12a集成，建立了一步miRNA检测平台。陈等人通过将基于RNA的CHA电路与CRISPR/Cas12a集成，建立了一步miRNA检测平台。RCT被miRNA特异性启动生成长的单链RNA，导致产生大量CRISPR/Cas12a前体crRNA重复序列，用于自身crRNA修剪和组建，进一步激活其反式切割活性。基于RCT结合CRISPR/Cas12a，建立了miRNA检测的生物传感器。“入侵堆叠引物”扩增反应作为链置换扩增反应，将每个miRNA转化为大量的DNA，触发CRISPR/Cas12a的反式裂解核酸酶活性。李等人制作了一个通过“入侵堆叠引物”扩增反应和CRISPR/Cas12a检测miRNA的即时检测平台。李等人引入级联脚趾介导的链置换反应(CTSDR)并结合CRISPR/Cas12a反式裂解用于miRNA检测。在本研究中，将靶miRNA与合理设计的探针杂交后启动动态CTSDR，导致无酶靶点循环和产生多个可编程DNA双链，触发
CRISPR/Cas12a反式裂解。严等人将连接酶链反应与CRISPR/Cas12a结合，开发了一种超灵敏、均匀的miRNA检测策略。此外，双链特异性核酸酶(DSN)表现出特殊的底物特异性，在DNA/RNA杂交体中只水解DNA，而不考虑核苷酸片段。通过双特异性核酸酶辅助的CRISPR/Cas12a策略，建立了用于检测miRNA的生物传感平台。
[0004]点击化学由Sharpless,Kolb and Finn在2001年首次提出，是通过连接碳异原子键快速合成有用的新化合物。近年来，无铜点击化学反应作为一种信号放大策引起了广泛的关注。与DNA或RNA连接酶不同，点击化学依赖于叠氮化物(N3)和二苯并环辛烯(Aza
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DBCO)两个基团之间的化学反应，具有更高的连接效率和更好的相容性。在目标序列存在的情况下，Aza
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DBCO和N3可以在恒温、无金属离子催化的条件下相互接近杂化，自发地完成点击反应。此外，Aza
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DBCO和N3不受羧酸、胺和硫醇的影响，避免了蛋白质和其他分子共存时的干扰，这使得点击化学具有分析复杂样品的潜力。因此，点击化学反应已广泛应用于核酸分析、生物学、DNA纳米技术等领域。
[0005]TdT是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，催化脱氧核糖核苷酸重复添加到单链和双链DNA/RNA的3'
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OH端。TdT反应需要包含至少3个碱基的短序列作为引物。当使用RNA作为模板时，TdT可以严格依赖于受体RNA 3'末端三级结构和核苷酸的类型。TdT的聚合活性与模板链无关，聚合反应可以在等温条件下完成。TdT被用作定量金属离子、靶RNA和外泌体的多功能工具。公开文献“一种基于DSN/TdT循环消化策略的简单而灵敏地检测miRNAs的荧光生物传感器”，详见：He,J.L.,et al.,DSN/TdT recycling digestion based cyclic amplification strategy for microRNA assay.Talanta,2020.219:p.121173。史等人开发了一种电化学分析方法，通过催化发夹组装和TdT催化DNA延伸用来无标记和高灵敏度检测人血清中的凝血酶。基于点击化学和TdT的优势，本专利技术建立了点击化学
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TdT(ccTdT)核酸等温扩增技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种基于点击化学末端脱氧核苷酸转移酶结合CRISPR/Cas12a对miRNA的检测方法。方法将含有miRNA互补片段被连接的DNA链通过链霉亲和素
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生物素相互作用附着在磁珠(MBs)表面，MBs通过磁分离被保留。在dTTP和TdT存在的情况下，连接的DNA链和互补链miRNA暴露的游离3'
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OH端可以产生连续的poly
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T。crRNA的识别区域包含一个21bp的poly
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A尾巴。扩展的poly
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T尾巴可以作为激活剂，补充crRNA，激活CRISPR/Cas12a的反式切割，切割报告基因，产生荧光信号。
[0007]探针A(PA)和探针B(PB)的部分与miRNA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法，其特征在于：将含有miRNA互补片段被连接的DNA链通过链霉亲和素
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生物素相互作用附着在磁珠(MBs)表面，MBs通过磁分离被保留；在dTTP和TdT存在的情况下，连接的DNA链和互补链miRNA暴露的游离3'
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OH端可以产生连续的poly
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T；crRNA的识别区域包含一个21bp的poly
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A尾巴；扩展的poly
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T尾巴可以作为激活剂，补充crRNA，激活CRISPR/Cas12a的反式切割，切割报告基因，产生荧光信号。2.根据权利要求1所述的一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法，其特征在于以下步骤：步骤1：制备crRNA(1)将2μL crRNA模板和2μL T7启动子(100μM)混合在14μL无酶水中；将混合物在95℃下孵育5min，然后逐渐冷却至25℃，放置2h；(2)将10μL 100mM dNTP缓冲液和2μL T7 RNA聚合酶混合；在37℃下转录16h，进而转录出大量的靶crRNA；(3)用DNaseI在37℃下降解crRNA模板15min；然后使用RNA清除试剂盒纯化已获得的crRNA，并在无DNase/rNase的水中重新溶解；(4)使用NanoDrop 1000(Waltham，MA，USA)测量crRNA的浓度，并在使用前保存在
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80℃；步骤2：miRNA的检测(1)将不同浓度的miRNA<...

【专利技术属性】
技术研发人员：万家余，李忠义，郝镯，刘文森，董明鑫，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：