一种测序技术中的文库制备方法技术

本发明专利技术公开了一种测序技术中的文库制备方法，通过对固相微球上的cDNA链进行等温延伸，将微球上的cDNA单链变成双链，然后再以双链为模板进行PCR扩增。由于第二条合成的cDNA链并没有与微球共价连接，只是与第一条cDNA互补，因此，在PCR时95℃的高温变性时，第二条链就会进入溶液相，进行“液

【技术实现步骤摘要】
一种测序技术中的文库制备方法


[0001]本专利技术涉及一种测序技术中的文库制备方法。

技术介绍

[0002]近年来单细胞测序技术(scRNA
‑
seq)快速发展，已经成为揭示细胞间异质性的强大工具。基于微孔、拆分混合和液滴微流控等技术的高通量测序方法可以实现对数千个细胞的同时分析。其中，大多数高通量scRNA
‑
seq平台是依靠固相编码微球实现大规模并行处理，如2015 年的Drop
‑
seq，2017年的Seq
‑
Well等，都是通过分离单个细胞和带有polyT特定编码的微球，在逆转录过程中微球对细胞释放的带有PloyA尾巴的mRNA分子进行捕获，然后通过逆转录酶对微球上捕获的mRNA进行反转录，合成第一条cDNA。基于逆转录酶的末端转移酶活性，第一条cDNA的3
’
端会加上扩增的引物，用于后续的PCR扩增。由于PCR扩增是以指数形式进行放大，所以很容易形成扩增偏差。
[0003]目前的方式，文库中cDNA的丰富性比较低，导致基因检出数降低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的，在于提供一种测序技术中的文库制备方法。其能够提高cDNA的丰富性，从而提高基因检出数。
[0005]本专利技术解决其技术问题的所采用的技术方案是：
[0006]一种测序技术中的文库制备方法，包括如下步骤：
[0007]1)将细胞中的mRNA捕获到固相界面；
[0008]2)对mRNA进行反转录，合成第一条cDNA；
[0009]3)在“固
‑
液”界面扩增时，将cDNA单链为初始模板转化为双链为模板，再以双链为模板进行PCR扩增。
[0010]优选地，进行第二链所用的酶包括热启动高保真酶ReadyMix，Klenow Fragment，PCR直扩Terra聚合酶预混液中的至少一种。
[0011]优选地，“固
‑
液”界面中的固相界面包括但不限于固相平面，固相曲面。
[0012]优选地，步骤2)中，第一cDNA单链的长度范围为5
‑
50kb。
[0013]优选地，步骤2)中固相界面上的第一cDNA单链的条数为1
‑
10
20
条。
[0014]优选地，步骤3)中，采用等温或者变温延伸的方法将固相微球上的第一cDNA链转变成双链。
[0015]本专利技术的优点如下：
[0016]目前基于固相微球的高通量单细胞测序方法，以固相微球的单链cDNA为模板开始扩增，这种“固
‑
液”形式的扩增会导致扩增的效率大大降低，因此在扩增初始阶段，只有一部分的 cDNA链会进行扩增。由于先完成扩增的cDNA，不再连接在固相微球上，而是进入溶液相，扩增界面也由“固
‑
液”面，转变为“液
‑
液”面，扩增效率大大提高。所以，先完成“固
‑
液”相上扩增的cDNA相比于后完成“固
‑
液”相扩增的cDNA会产生更多的模板链，形成极大的
扩增偏差，使得最终文库中少量的cDNA占据了文库中的大部分，从而降低文库中cDNA的丰富性，导致基因检出数降低。由于先前的扩增方式存在“固
‑
液”界面扩增到“液
‑
液”界面扩增的转变，而“固
‑
液”界面扩增的效率低，不能让所有的“固
‑
液”界面上cDNA模板同时合成第二条链，转变成“液
‑
液”界面扩增，导致扩增偏差加大，降低文库的丰富度。本专利技术采用二链合成技术，即：对固相微球上的cDNA链进行等温延伸，将微球上的cDNA单链变成双链，然后再以双链为模板进行PCR扩增。由于第二条合成的cDNA链并没有与微球共价连接，只是与第一条cDNA互补，因此，在PCR时95℃的高温变性时，第二条链就会进入溶液相，进行“液
‑
液”相扩增。由于扩增之前，对微球上的cDNA进行了二链合成，所以经过高温变性，微球的cDNA会同时脱落，进入溶液相进行“液
‑
液”相扩增，这样就解决了之前扩增时以固相微球上的单链cDNA模板进行扩增导致的扩增偏差问题。
附图说明
[0017]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。
[0018]图1为PDMS芯片的结构示意图。
[0019]图2为图1的局部放大。
[0020]图3为实施例1细胞与微球的高效配对，可以看到细胞在芯片上的占有率高达80％以上。
[0021]图4为芯片的结构示意图之二。
[0022]图5将捕获了单个细胞裂解释放的mRNA的编码微球均分成两份，其中一份经逆转生成 cDNA，直接进行扩增。
[0023]图6另一份经逆转录生产cDNA后，先进行微球上cDNA的第二链合成，然后再扩增。
[0024]图7经过二链合成的文库的基因检出数远高于未经过二链合成的文库的基因检出数。
具体实施方式
[0025]一种测序技术中的文库制备方法，包括如下步骤：
[0026]1)将细胞中的mRNA捕获到固相界面；
[0027]2)对mRNA进行反转录，合成第一条cDNA；
[0028]3)在“固
‑
液”界面扩增时，将cDNA单链为初始模板转化为双链为模板，再以双链为模板进行PCR扩增。
[0029]优选地，步骤1)之前，还包括如下步骤：
[0030]a.将单个细胞和单个带有polyT的编码微球混合；
[0031]b.逆转录过程中编码微球对细胞释放的带有PloyA尾巴的mRNA分子进行捕获。
[0032]优选地，步骤a)中，采用芯片进行，所述的芯片具有多个用于捕获单个细胞和单个微球的微孔单元。当然，本专利技术也可以采用其它任何现有的将单个细胞和单个微球组合在一起的技术。
[0033]优选地，所述的微孔单元包括位于下层的正方形微孔，用于细胞捕获，以及位于上层的六边形微孔，用于微球捕获，下层的正方形微孔和上层的六边形微孔连通。
[0034]优选地，下层的正方形微孔水平横截面积小于上层的六边形微孔水平横截面积。
[0035]优选的，步骤b)中，编码微球上的第一cDNA单链的条数为1
‑
10
20
条。
[0036]优选的，步骤2)中，第一cDNA单链的长度范围为5
‑
50kb。
[0037]优选的，步骤3)中，采用等温延伸的方法将固相微球上的第一cDNA链转变成双链。在其它的实施例中，也可以采用其它的方法将固相微球上的第一cDNA链转变成双链。
[0038]优选的，等温延伸的时间为10min
‑
200min。进一步优选，为10
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90min。
[0039]优选的，等温延伸所采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测序技术中的文库制备方法，包括如下步骤：1)将细胞中的mRNA捕获到固相界面；2)对mRNA进行反转录，合成第一条cDNA；3)在“固
‑
液”界面扩增时，将cDNA单链为初始模板转化为双链为模板，再以双链为模板进行PCR扩增。2.根据权利要求1所述的一种测序技术中的文库制备方法，其特征在于：进行第二链合成所用的酶包括DNA聚合酶，RNA聚合酶，Klenow酶，DNA连接酶。3.根据权利要求1所述的一种测序技术中的文库制备方法，其特征在于：“固
‑
液”界面中的固相界面包括但不限于固相平面或固相曲面。4.根据权利要求1所述的一种测序技...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，尹坤，赵美娟，许依玲，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：