甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，尤其涉及甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用。并且本发明专利技术提供了体外转录的试剂和对核酸的检测方法和试剂。本发明专利技术研究发现通过添加适量浓度的甜菜碱能够提高DNA的体外转录效率，从而提高对ssRNA的检测体系中靶标RNA的产量，进而可显著提高对ssRNA检测的灵敏度。特别是将本发明专利技术所述的DNA体外转录试剂与CRISPR基因编辑技术联用，有助于推动CRISPR

【技术实现步骤摘要】
甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用。

技术介绍

[0002]转录(transcription)是指以DNA为模板，以ATP、UTP、GTP和CTP为原料，按照碱基互补原则，在RNA聚合酶的作用下合成RNA的过程。转录通常发生在生物体内，在体外无细胞系统中，用DNA作为模板，添加RNA转录酶和NTP，从而模仿体内转录过程生成RNA，这样的技术被称为体外转录。
[0003]目前，多种检测方法都需要在检测前将DNA经体外转录形成RNA。例如，在CRISPR
‑
Cas13a技术中，先将样本DNA转录为ssRNA，然后再利用CRISPR
‑
Cas13a检测技术对ssRNA进行检测。如果待测目标物的遗传物质为RNA，则可先经过逆转录过程，再经过转录获得ssRNA，然后进行检测。
[0004]CRISPR
‑
Cas13是向导RNA介导的RNA靶向的内切酶系统，是目前CRISPR
‑
Cas家族中唯一的一支靶向ssRNA(单链RNA)的系统，为RNA靶向和RNA编辑奠定了基础。Cas13a
‑
crRNA复合物中的crRNA将精准识别与之互补的序列并匹配后，Cas13a将外源单链RNA剪切，Cas13特异性切割靶标片段后，进入激活状态，可非特异性切割任意ssRNA。根据Cas13a被激活后的非特异性酶切活性，在体系中添加5
’<br/>端标记荧光基团(FAM)，3
’
端标记淬灭基团(BHQ1)的报告RNA，可通过检测FAM基团荧光信号将该编辑系统应用于体外诊断中。由于CRISPR
‑
Cas13a检测技术具有低温检测减少气溶胶污染、特异性高以及无需精密仪器检测等优点，且该检测方法原理虽复杂，但操作简便，易上手，将有助于推动CRISPR技术在体外诊断中的应用，如病毒检测，病菌识别和耐药性基因确认，即时检测(POCT)等。
[0005]但是CRISPR
‑
Cas13介导的检测方法相较于qPCR检测，其灵敏度存在一定的挑战性，其根本原因是CRISPR检测体系中的靶标RNA浓度较低，导致Cas13a蛋白特异性切割ssRNA后，被激活的侧向切割活性较低，报告RNA被剪切释放的FAM基团过少，从而导致检测灵敏度低。
[0006]因此提高检测体系中的靶标RNA浓度或拷贝数，可提高CRISPR
‑
Cas13a检测技术的灵敏度。而这对体外转录的方法提出了更高的要求。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用，从而获得高丰度的ssRNA，以提高CRISPR
‑
Cas13a技术检测的灵敏度。
[0008]本专利技术提供了甜菜碱在提高DNA体外转录效率中的应用。
[0009]本专利技术中，所述的提高体外转录效率的甜菜碱添加量为0.1～1M，本专利技术实施例表明，在体外转录体系中添加甜菜碱，能够提高转录效率。并且，在一定的浓度范围内，转录产物ssRNA的检测荧光信号随着甜菜碱浓度的增加而提高。并且，甜菜碱对体外转录效率的促
进作用，不受转录酶品质的影响，也不会对其后对于所得转录产物ssRNA的检测效果产生不利的干扰。
[0010]所述对RNA的检测需首先进行逆转录，并进行扩增，所述的扩增包括但不限于PCR或恒温扩增，所述恒温扩增包括LAMP、ERA、NERA、NASBA、RCA、HAD、RPA、RAA。对转录产物ssRNA的检测方法包括RT
‑
PCR或CRISPR
‑
Cas13a、CRISPR
‑
Cas13b。
[0011]本专利技术提供的DNA体外转录试剂包括：甜菜碱、RNA转录酶、NTP和缓冲液。
[0012]本专利技术实施例中，所述DNA体外转录试剂包括水和：Tris
‑
HCl、MgCl2、亚精胺、DTT、BSA、NP
‑
40、NTP、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂、T7 RNA聚合酶和甜菜碱。
[0013]本专利技术所述的DNA体外转录试剂中，甜菜碱的浓度为0.1～1mol/L。
[0014]一些实施例中，所述DNA体外转录试剂由水和如下浓度的组分组成：50mM Tris
‑
HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mL BSA、0.03％NP
‑
40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μL RNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶、0～1M甜菜碱。
[0015]一些具体实施例中，所述甜菜碱在DNA体外转录试剂中的浓度为100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM或1M。
[0016]进一步的，本专利技术还提供了DNA体外转录方法，其包括：将模板DNA与本专利技术所述的DNA体外转录试剂混合后进行孵育。
[0017]本专利技术所述的DNA体外转录方法中，所述DNA为人工合成、提取获得或者由RNA逆转录而来。本专利技术对此不做限定，其皆可应用本专利技术所述的方法进行体外转录，并获得良好的转录效率。例如：提取获得的DNA或者逆转录的RNA模板来自于生物体或环境样本。所述生物体包括动物、植物或微生物。作为举例，所述动物包括人类、家畜或家禽；所述植物包括粮食作物或经济作物；所述微生物包括工业用微生物、食用微生物或病原微生物。本专利技术中，所述微生物包括但不限于病毒、噬菌体、原核生物或真核生物。本专利技术中，所述环境样本包括来自于自然环境或者来自于商超、实验室、酒店、车站、机场等场所的样本。
[0018]本专利技术所述的DNA体外转录方法中，转录体系中包括：水和Tris
‑
HCl、MgCl2、亚精胺、DTT、BSA、NP
‑
40、NTP、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂、T7 RNA聚合酶、甜菜碱和DNA。
[0019]本专利技术实施例中，所述DNA体外转录体系的体积为20μL，具体实施例中，其由水和如下浓度的组分组成：50mM Tris
‑
HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、8mM亚精胺、2mM DTT、50μg/mL BSA、0.03％NP
‑
40、0.5mM NTP、0.02U无机焦磷酸酶、5U/μL RNA酶抑制剂、50U T7 RNA聚合酶、0～1M甜菜碱、10μL DNA。
[0020]本专利技术所述体外转录中，所述孵育在30～40℃下进行，优选的孵育温度为37℃，孵育的时间为10～30min，优选的，孵育时长为30min。
[0021]更进一步的，本专利技术还提供了核酸检测试剂，其包括：本专利技术所述的DNA体外转录试剂。其还包括转录产物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甜菜碱作为提高DNA体外转录效率的制剂的应用。2.DNA体外转录试剂，包括：甜菜碱、RNA转录酶、NTP和缓冲液。3.根据权利要求2所述的DNA体外转录试剂，其特征在于，包括水和：Tris
‑
HCl、MgCl2、亚精胺、DTT、BSA、NP
‑
40、NTP、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂、T7 RNA聚合酶和甜菜碱。4.根据权利要求2或3所述的DNA体外转录试剂，其特征在于，其中甜菜碱的浓度为0.1~1 mol/L。5.DNA体外转录方法，其特征在于，包括：将模板DNA与权利要求2~4任一项所述的DNA体外转录试剂混合后进行孵育。6.核酸检测试剂，其特征在于，包括：权利要求2~4任一项所述的DNA体外转录...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐灿，王金林，
申请(专利权)人：三诺生物传感股份有限公司，
类型：发明
国别省市：