一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法技术

本发明专利技术涉及转化纯化领域，尤其涉及IPC C12Q1领域，更具体地，涉及一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法。通过控制转化条件，可促进DNA双链处于解链状态，促进转化的同时，减少DNA降解等的发生，从而促进对多种样本，即便是难检测的血浆等样本的检测，其次，通过后续纯化提取，还可缩短纯化流程和时间的同时，提高DNA的回收率，用于更少量样本的检测，排除不同样本中残留基因组的干扰，提高检测灵敏性和准确度。测灵敏性和准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法


[0001]本专利技术涉及转化纯化领域，尤其涉及IPCC12Q1领域，更具体地，涉及一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是修饰最稳定的表观遗传方式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表观。现有技术中，人们通常采用重亚硫酸盐转化方式来研究DNA甲基化。DNA在重亚硫酸盐处理过程中会将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。随后用重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性PCR法、限制性酶切分析法等来比较处理和未处理DNA的序列，就能确定DNA序列中哪些位点发生甲基化。但是传统重亚硫酸盐转化法反应时间长，且DNA降解率高，检测出DNA的灵敏度和准确度低，且一致性和重复性差，不方便应用。
[0003]现有技术中，授权公告号为CN 105462960B的专利申请文件，公开了一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，选用的甲基化转化试剂和磁珠法纯化试剂，能够进行恒温转化，且使用过程中不使用氢氧化钠变性处理，提高了回收效率和DNA纯度，但是其灵敏度较低，不适合检测微小残留疾病分子。
[0004]授权公告为CN103205418B的专利申请文件，公开了一种在DNA重亚硫酸盐转化过程中纯化DNA的方法，通过加入DNA保护剂，放置DNA在转化过程中降解，从而提高了核酸对于的回收率和测试灵敏度，但是对于难检测的血浆等样本检测效果较差。
[0005]因此，需要一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，不仅能够缩短反应时间，且能够降低DNA的降解率，提高检测灵敏度和准确度，同时还能够提高DNA的纯度和回收率，可以应用于绝大多数包括难检测的血浆等样本的检测。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术第一方面，提供了一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法，包括以下步骤：取样本加入重亚硫酸盐溶液、核酸保护液混合后，进行PCR孵育转化。
[0007]优选的，所述样本为外周血、血浆或血清、新鲜组织、细胞株、石蜡组织中的一种或多种样品中提取的DNA。
[0008]优选的，所述重亚硫酸盐溶液的配置步骤为：向6000mg重亚硫酸盐中加入954ul重亚硫酸盐溶解液，搅拌均匀即得。
[0009]优选的，所述重亚硫酸盐选自亚硫酸氢铵、重亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸氨、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁中的一种或多种。
[0010]优选的，所述重亚硫酸盐溶解液为pH值大于7的化合物的水溶液；所述pH值大于7的化合物的摩尔浓度为0.1
‑
1M；进一步优选的，为0.5
‑
0.75M。
[0011]优选的，所述pH值大于7的化合物为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钡、氢氧化镁、碳酸钙中的一种或多种；进一步优选的，为氢氧化钠。
[0012]优选的，所述重亚硫酸盐溶解液的配制步骤为：称取适量pH值大于7的化合物，加
入水，充分溶解混匀，即得。
[0013]优选的，所述核酸保护液包括水溶性维生素和醚类杂环化合物。
[0014]优选的，所述水溶性维生素为水溶性维生素C、水溶性维生素E中的一种或多种；进一步优选的，为水溶性维生素E。
[0015]优选的，所述水溶性维生素E为6
‑
羟基
‑
2,5,7,8
‑
四甲基苯并二氢吡喃
‑2‑
甲酸。
[0016]优选的，所述醚类杂环化合物为1,4
‑
二氧六环、1,3,6
‑
三氧杂环辛烷、四氢吡喃
‑4‑
醇、四氢呋喃中的一种或多种；进一步优选的，为1,4
‑
二氧六环。
[0017]优选的，所述水溶性维生素在核酸保护液中的摩尔浓度为0.05
‑
0.15mol/L。
[0018]优选的，所述核酸保护液的配置步骤为：取水溶性维生素与醚类杂环化合物混合，充分溶解，即得。
[0019]虽然选用重亚硫酸盐溶液来将核酸碱基中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但是其含碱量较高，反应体系中会生成大量活性氧基团，使得核酸发生片段化并发生降解，从而影响检测的灵敏度和后续纯化提取DNA的回收率。申请人意外发现，选用一定量的6
‑
羟基
‑
2,5,7,8
‑
四甲基苯并二氢吡喃
‑2‑
甲酸作为水溶性维生素，和1,4
‑
二氧六环作为醚类杂环化合物共同制备的核酸保护液，能够减少pH值大于7的化合物的添加对核酸处理过程中造成的核酸降解和片段化。特别的，当水溶性维生素在核酸保护液中的摩尔浓度为0.05
‑
0.15mol/L时，能够在少核酸降解的同时，促进未甲基化的胞嘧啶的转化。这可能是由于6
‑
羟基
‑
2,5,7,8
‑
四甲基苯并二氢吡喃
‑2‑
甲酸与1,4
‑
二氧六环协同作用，增强了酚羟基的酸性的同时，避免了过量的有机溶剂的使用可能会对细胞产生毒性，使得其抗氧化活性有所提升，从而能够保护核酸链，减少pH值大于7的化合物造成的核酸降解和片段化。但是对转化时间的促进有限。
[0020]优选的，所述PCR孵育转化选用PCR仪进行孵育转化。
[0021]优选的，所述PCR孵育转化的程序为(95
‑
105)℃，(10
‑
20)min；(45
‑
55)℃，(25
‑
35)min；(95
‑
105)℃，(1
‑
10)min；(45
‑
55)℃，(85
‑
95)min；进一步优选的，为99℃，15min；50℃，30min；99℃，5min；50℃，90min。
[0022]申请人发现，选用PCR仪进行孵育转化，且PCR孵育转化的程序为(95
‑
105)℃，(10
‑
20)min；(45
‑
55)℃，(25
‑
35)min；(95
‑
105)℃，(1
‑
10)min；(45
‑
55)℃，(85
‑
95)min，能够在缩短流程，节约转化时间的同时，还能够促进DNA双链处于解链状态，从而促进对多种样本的检测。这可能是由于人为操作误差会影响到核酸的产量和纯度，而选用PCR仪进行孵育转化，不仅精密度高且效率高，还大大降低了人工成本。而孵育转化过程中，转化时间过长会影响核酸结构完整性，转化时间过短会导致转化不完全，二者都会导致检测信号过低或无信号，影响DNA甲基化检测灵敏度。申请人通过多次创造性实验，意外发现当PCR孵育转化的程序为(95
‑
105)℃，(10
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法，其特征在于，包括以下步骤：取样本加入重亚硫酸盐溶液、核酸保护液混合后，进行PCR孵育转化。2.根据权利要求1所述的一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法，其特征在于，所述样本为外周血、血浆或血清、新鲜组织、细胞株、石蜡组织中的一种或多种样品中提取的DNA。3.根据权利要求1或2所述的一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法，其特征在于，所述核酸保护液包括水溶性维生素和醚类杂环化合物；所述水溶性维生素在核酸保护液中的摩尔浓度为0.05
‑
0.15mol/L。4.根据权利要求3所述的一种核酸碱基的重亚硫酸盐转化方法和提取、纯化方法，其特征在于，所述PCR孵育转化的程序为95
‑
105℃，10
‑
20min；45
‑
55℃，25
‑
35min；95
‑
105℃，1
‑
10min；45
‑
55℃，85
‑
95min。5.一种核酸碱基的重亚硫酸盐提取、纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将权利要求1
‑
4任一项所述的方法孵育转化后的样本、裂解液、磁珠混合后，分离磁珠，弃上清；S2、加入去磺化溶液去磺化后，再次分离磁珠，弃上清；S3...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯中和，谢立群，熊慧，肖晓，刘以哲，汪佳贝，詹冬，黄爱天，罗碧珍，
申请(专利权)人：上海思泰得医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：