一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，属于疫苗领域，包括：扩增布鲁氏菌16M的BP26基因；扩增乳酸乳球菌MG1363的锚钩蛋白PA基因；将BP26基因和PA基因进行重叠PCR扩增后，将融合基因BP26‑PA克隆至原核表达载体中获得重组质粒；将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建重组表达菌；将构建的重组表达菌接种于卡那抗性液体培养基中，培养至OD<subgt;600nm</subgt;为0.6～0.8时加入IPTG进行重组融合蛋白BP26‑PA的诱导表达；制备BLPs；表面展示布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备。本发明专利技术的布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗安全性高，免疫性能好。
1、布鲁氏菌病(brucellosis)是由胞内寄生的布鲁氏菌(brucella)引起的危害严重的人畜共患传染病，既威胁人类健康，又影响畜牧业发展，还可危及食品安全，造成严重的社会和经济损失。
2、布鲁氏菌是革兰氏阴性胞内寄生菌，属于α变形菌门，根瘤菌目，布鲁氏菌科，布鲁氏菌属的成员。至今已发现的布鲁氏菌属可分为12个种，分别是羊种(b.melitensis)、牛种(b.abortus)、猪种(b.suis)、犬种(b.canis)、绵羊附睾种(b.ovis)、沙林鼠种(b.neotomae)、鲸型(b.ceti)、鳍型(b.pinnipedialis)、田鼠种(b.microti)、歧见玛瑙宝螺种(b.inopinata)、狒狒种(b.papionis)、赤狐种(b.vulpis)。不同种布鲁氏菌的基因同源性可高达94％，但不同种布鲁氏菌的人畜共患病潜力不一样。布鲁氏菌的许多蛋白能引起机体一系列的免疫反应。布鲁菌bp26蛋白，又名cp28或者omp28，该蛋白的基因全长753bp，编码250个氨基酸，是一种具有强免疫原性的外膜蛋白，可由细胞内向细胞外释放的可溶性蛋白。布鲁氏菌bp26基因在不同种间的序列高度保守，有研究证明了bp26蛋白敏感性强，特异性好，是一种重要的布鲁氏菌诊断抗原，其常被广泛应用于血清学诊断的研究。也有研究报道bp26蛋白对小鼠具有一定保护作用，可为新型布鲁氏菌疫苗及诊断制剂的研究提供实验依据。
>3、布鲁氏菌是兼性细胞内寄生菌，药物治疗往往很难取得预期的治疗效果。因此，疫苗接种是预防布鲁氏菌病的关键措施。目前临床使用的疫苗大部分为减毒活疫苗，残存一定毒力，安全性有待提高。因此，研制安全、有效的新型布鲁氏菌候选疫苗对预防布鲁氏菌病，以及对畜牧业和公共卫生事业发展具有极为重要的现实意义。4、细菌样颗粒(bacterium-like particles，blps)，又称革兰氏阳性增强基质(gram-positive enhancermatrix，gem)，是一种非活性、非遗传修饰的球型颗粒，主要成分是乳酸乳球菌肽聚糖骨架，因其大小和形态与活菌相似，故称为细菌样颗粒。细菌样颗粒表面展示技术由bosma等人首次提出并研发，该技术作为一种新型的乳酸乳球菌表面展示技术，近年来在疫苗研制中被广泛应用并表现出巨大的发展潜力。目前，包括流感病毒、志贺菌属及伯氏疟原虫等在内的多种病原体已成功制备细菌样颗粒疫苗，且实验免疫研究均取得良好的免疫效果。目前为止还没有布鲁氏菌细菌样颗粒疫苗的相关研究报道。因此，构建布鲁氏菌细菌样颗粒疫苗，可为开发具有良好免疫原性且无安全隐患的布鲁氏菌候选疫苗奠定基础，为预防人和动物的布鲁氏菌病提供技术支撑。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法。
2、本专利技术首次以布鲁氏菌强毒株16m的bp26抗原基因为靶基因，制备得到重组融合蛋白bp26-pa，通过将重组融合蛋白bp26-pa展示到细菌样颗粒(bacterium-likeparticles，blps)表面从而制备得到本专利技术的一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗。本专利技术通过将gem-pa表面展示系统应用于布鲁氏菌细菌样颗粒疫苗制备中，制备出了一种安全性高、免疫性能好的布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗。
3、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
4、本专利技术的一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其具体包括以下步骤：
5、步骤1：重组质粒pet-28a-bp26-pa的构建；
6、步骤1.1：引物设计与合成；
7、步骤1.2：扩增布鲁氏菌16m的bp26基因(序列见seq id no.1)；
8、步骤1.3：扩增乳酸乳球菌mg1363的锚钩蛋白pa基因(序列见seq idno.2)；
9、步骤1.4：将bp26基因和pa基因进行重叠pcr扩增后，将获得的融合基因bp26-pa(序列见seq id no.3)克隆至pet-28a原核表达载体中，将pcr鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定正确的重组质粒命名为pet-28a-bp26-pa；
10、步骤2：重组融合蛋白bp26-pa的表达；
11、步骤2.1：将重组质粒pet-28a-bp26-pa转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞中，构建重组表达菌；
12、步骤2.2：将构建的重组表达菌接种于卡那抗性液体培养基中，培养至od600nm为0.6～0.8时加入iptg进行重组融合蛋白bp26-pa的诱导表达；
13、步骤3：blps的制备与鉴定；
14、步骤4：表面展示布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备；
15、将重组融合蛋白bp26-pa超声破碎后的上清液与blps混合，室温下翻转结合，离心后的沉淀为含有重组融合蛋白bp26-pa的blps，即布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗。
16、作为优选的实施方式，步骤1.1中，所设计的引物(5’→3’)信息如下：
17、bp26-f：cgcggatccatgaacactcgtgctagcaattttctcgca；
18、bp26-r：tgaagaagctcccttgatttcaaaaacgacattgaccgata c；
19、pa-f：tttgaaatcaagggagcttcttcagctggaaatactaattct；
20、pa-r：gcgctcgagtcattttattcgtagatactgaccaattaa。
21、作为优选的实施方式，步骤1.2的具体操作流程如下：以布鲁氏菌16mdna为模板、bp26-f和bp26-r为上下游引物，经pcr扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在771bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收。
22、作为优选的实施方式，步骤1.3的具体操作流程如下：以乳酸乳球菌mg1363 dna为模板、pa-f和pa-r为上下游引物，经pcr扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在693bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收。
23、作为优选的实施方式，步骤1.4的具体操作流程如下：将bp26基因和pa基因的混合物作为模板，以bp26-f和pa-r作为上下游引物进行pcr扩增；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在1440bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收；将获得的融合基因bp26-pa与pet-28a载体分别进行双酶切，限制性内切酶分别为bamah i和xho i；双酶切产物分别通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带并纯化回收；将bp26-pa酶切片段和pet-28a酶切片段通过t4 dna连接酶进行连接，于16℃作用过夜；将酶连产物转化至e.coli dh本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1中，所设计的引物(5’→3’)信息如下：
3.根据权利要求2所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2的具体操作流程如下：以布鲁氏菌16M DNA为模板、BP26-F和BP26-R为上下游引物，经PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在771bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收。
4.根据权利要求2所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.3的具体操作流程如下：以乳酸乳球菌MG1363DNA为模板、PA-F和PA-R为上下游引物，经PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在693bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收。
5.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.4的具体操作流程如下：将BP26基因和PA基因的混合物作为模板，以BP26-F和PA-R作为上下游引物进行PCR扩增；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在1440bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收；将获得的融合基因BP26-PA与pET-28a载体分别进行双酶切，限制性内切酶分别为BamaH I和Xho I；双酶切产物分别通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带并纯化回收；将BP26-PA酶切片段和pET-28a酶切片段通过T4DNA连接酶进行连接，于16℃作用过夜；将酶连产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，将测序鉴定正确的重组质粒命名为pET-28a-BP26-PA。
6.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2-步骤1.4中，所述PCR扩增的反应程序均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。
7.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2-步骤1.4中，所述PCR扩增的反应体系均为：
8.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3的具体操作流程如下：将乳酸乳球菌MG1363划线接种于GM17固体培养基，30℃培养16～28h；挑取单菌落接种于GM17液体培养基，振荡过夜培养；将菌液接种GM17培养基，振荡培养12～16h；经离心收集菌体后，用PBS溶液洗涤菌体；用10％三氯乙酸溶液重悬菌体，煮沸、离心，弃去酸液，用PBS溶液充分重悬沉淀，离心取沉淀；重复洗涤沉淀3～5次后，用适量PBS溶液充分重悬沉淀，即获得BLPs，并通过细菌计数板对BLPs进行计数，2.5×109个/mL BLPs为1U。
9.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤4的具体操作流程如下：取BLPs与BP26-PA蛋白破碎上清混合，室温下翻转结合2h，4℃，8000rpm离心20min，弃去上清，收集沉淀，获得含有重组融合蛋白BP26-PA的BLPs；用预冷的无菌PBS溶液洗涤沉淀，用PBS重悬沉淀，即为布鲁氏菌BP26蛋白细菌样颗粒疫苗，命名为BLPs-BP26。
...
【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1中，所设计的引物(5’→3’)信息如下：
3.根据权利要求2所述的一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2的具体操作流程如下：以布鲁氏菌16m dna为模板、bp26-f和bp26-r为上下游引物，经pcr扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在771bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收。
4.根据权利要求2所述的一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.3的具体操作流程如下：以乳酸乳球菌mg1363dna为模板、pa-f和pa-r为上下游引物，经pcr扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在693bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收。
5.根据权利要求1所述的一种布鲁氏菌bp26蛋白细菌样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.4的具体操作流程如下：将bp26基因和pa基因的混合物作为模板，以bp26-f和pa-r作为上下游引物进行pcr扩增；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在1440bp左右获得目的条带，切下目的条带并纯化回收；将获得的融合基因bp26-pa与pet-28a载体分别进行双酶切，限制性内切酶分别为bamah i和xho i；双酶切产物分别通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带并纯化回收；将bp26-pa酶切片段和pet-28a酶切片段通过t4dna连接酶进行连接，于16℃作用过夜；将酶连产物转化至e.coli dh5α感受态细胞，将测序鉴定正...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，涂飞，林海，纪雪，孙洋，姜博文，李楠，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。