【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒，尤其涉及表达sars-cov-2的s、e和m蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用。
技术介绍
1、随着科学界对新型冠状病毒(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,sars-cov-2)的结构、功能和致病过程的深入研究以及针对sars-cov-2的治疗药物和单克隆抗体的开发，对sars-cov-2的治疗方法和治疗效果在不断改善，但仍存在治疗效果仍有待提升、成本较高以及存在一定副作用的问题。因此疫苗接种仍是预防和控制sars-cov-2最经济、有效的手段。病毒的不断突变使其具有更强的免疫逃逸能力。目前的报道表明，即使疫苗接种者体内存在高水平的中和抗体，面对受关注的变异株(vocs)仍有较高的突破性感染的风险，提示诱导体液免疫的疫苗可能不足以对sars-cov-2实现有效的保护性免疫。
2、金丝雀痘病毒(canarypox virus,cnpv)是痘病毒科(poxviridae)、脊椎动物痘病毒亚科(chordopoxvirinae,chpv)、禽痘病毒属(avipoxvirus,apv)的重要成员之一，其所在的禽痘病毒属是唯一仅感染非哺乳动物宿主的病毒属，具有较高的种属特异性与安全性。以金丝雀痘病毒作为载体生产的重组疫苗不会产生病毒载体的扩散，包括对非接种物和环境的影响。目前已构建了多种金丝雀痘病毒载体疫苗，如马流感病毒(equineinfluenza virus,eiv)，犬瘟热病毒(canine distemper virus,cdv)，
技术实现思路
1、本专利技术提供表达sars-cov-2的s、e和m蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用。
2、本专利技术以金丝雀痘病毒作为载体开发sars-cov-2的载体疫苗，构建表达sars-cov-2的s、e和m蛋白的重组金丝雀痘病毒，以期诱导高水平的针对sars-cov-2的细胞免疫和体液免疫，提高sars-cov-2疫苗的免疫效果。为保证sars-cov-2的s、e和m蛋白的高效表达，本专利技术首先对上述蛋白的启动子和表达盒结构进行了优化，显著提高了sars-cov-2的s、e和m蛋白的表达水平，进而更有利于提高重组病毒的免疫原性。
3、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
4、第一方面，本专利技术提供重组核酸分子，所述重组核酸分子包含重组金丝雀痘病毒基因组；
5、所述重组金丝雀痘病毒基因组为在金丝雀痘病毒基因组的c6编码区整合sars-cov-2表达盒得到；
6、其中，所述sars-cov-2表达盒包含第一表达盒和第二表达盒；
7、所述第一表达盒包含桑灯蛾昆虫痘病毒42k启动子和sars-cov-2的s基因；
8、所述第二表达盒包含牛痘病毒h6启动子以及sars-cov-2的e基因和m基因。
9、上述第二表达盒中，sars-cov-2的e基因和m基因共用牛痘病毒h6启动子驱动转录。
10、本专利技术发现，在单一位点插入大片段外源基因会导致表达量的降低，与将s基因、e基因和m基因置于同一启动子下转录并添加ires等独立起始翻译序列相比，各基因使用各自独立的启动子驱动转录的表达效果更优，然而，令人意外的是，与s基因、e基因和m基因均使用各自独立的启动子驱动转录相比，将s基因使用独立的启动子驱动转录，将e基因和m基因使用共同的启动子驱动转录的表达效果明显更优，而且更有利于病毒样颗粒的形成，能够显著提高重组病毒的病毒样颗粒的产量，且重组病毒作为免疫原具有更优的免疫效果。在上述发现的基础上，本专利技术进一步对启动子的选择进行了优化并发现，在众多的可选启动子中，第一表达盒和第二表达盒分别使用42k启动子和h6启动子驱动转录能够显著提高s基因、e基因和m基因的表达水平，保证其在重组病毒中高效稳定表达，同时更有利于病毒样颗粒的形成，能够显著提高重组病毒的病毒样颗粒的产量，且重组病毒作为免疫原具有更优的免疫效果。
11、优选地，所述第二表达盒还包含位于e基因和m基因之间的ires序列。
12、ires序列为自剪切自招募核糖体的序列，在共用启动子的e基因和m基因之间插入ires序列能够使得两基因单独翻译，保证两基因编码蛋白的正确翻译和折叠。
13、优选地，所述第一表达盒与所述第二表达盒的转录方向相反。
14、本专利技术在研发过程中意外地发现，将s基因的表达盒与e基因和m基因的表达盒的方向设置为相反方向(即第一表达盒和第二表达盒头对头、直接或间接相连)能够更有利于病毒样颗粒的形成，显著提高重组病毒的病毒样颗粒的产量，同时保证sars-cov-2基因的高表达水平，重组病毒作为免疫原具有更优的免疫效果。
15、为实现筛选过程可视化进而方便筛选，本专利技术在sars-cov-2表达盒中还引入了标记蛋白。引入标记蛋白使重组病毒的筛选过程可视化，经过3-5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，显著提高了获得重组病毒的效率。
16、优选地，在所述第一表达盒与所述第二表达盒之间还包含第三表达盒；所述第三表达盒包含启动子和标记蛋白编码基因。
17、优选地，所述第三表达盒的转录方向与所述第二表达盒相同。
18、优选地，所述第三表达盒的启动子为桑灯蛾昆虫痘病毒42k启动子，和/或，所述标记蛋白为荧光标记蛋白。
19、对于荧光标记蛋白的种类，本专利技术没有特殊限制。可选地，所述荧光标记蛋白选自红色荧光蛋白mcherry、绿色荧光蛋白egfp或黄色荧光蛋白yfp。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子包含重组金丝雀痘病毒基因组；
2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第二表达盒还包含位于E基因和M基因之间的IRES序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第一表达盒与所述第二表达盒的转录方向相反。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组核酸分子，其特征在于，在所述第一表达盒与所述第二表达盒之间还包含第三表达盒；
5.根据权利要求1～4任一项所述的重组核酸分子，其特征在于，所述SARS-CoV-2表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求1～5任一项所述的重组核酸分子；
7.重组金丝雀痘病毒，其特征在于，所述重组金丝雀痘病毒的基因组为权利要求1～5任一项所述的重组核酸分子；
8.权利要求7所述的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9技术在金丝雀痘病毒基因组的C6编码区整合SARS-CoV-2表达盒；
10.一种SARS-CoV-2疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求7所述的重组金丝雀痘病毒或由权利要求7所述的重组金丝雀痘病毒制备得到。
...【技术特征摘要】
1.重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子包含重组金丝雀痘病毒基因组；
2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第二表达盒还包含位于e基因和m基因之间的ires序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其特征在于，所述第一表达盒与所述第二表达盒的转录方向相反。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组核酸分子，其特征在于，在所述第一表达盒与所述第二表达盒之间还包含第三表达盒；
5.根据权利要求1～4任一项所述的重组核酸分子，其特征在于，所述sars-cov-2表达盒的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.生物材料，其特征在于，所述生物材...
【专利技术属性】
技术研发人员：闫飞虎，王玮琦，冯娜，孟宪踊，赵永坤，王铁成，夏咸柱，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。