【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及角膜细胞工程，特别涉及一种角膜脱细胞的方法。
技术介绍
1、角膜是维持人体正常视力最重要的组织之一，天然角膜从外至内是由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层组成，其中基质层是由有序的胶原束与蛋白聚糖排列组成的透明组织，胶原束直径为22～32nm，间距约30nm，该空间距离是由胶原与蛋白聚糖分子中的氢键所维持，这种结构能阻止散光发生，并为角膜提供特殊生物力学性能以抵御眼内压力。
2、角膜会由于发生圆锥角膜、大泡性角膜、真菌感染、外伤瘫痕等疾病造成视力下降或失明，中国公民因单眼和双眼角膜病致盲的盲人约300～500万，仅次于白内障，现今角膜盲已成为全球第二大致盲性疾病。导致角膜盲的主要疾病包括各种感染性角膜病、角膜变性、严重机械外伤、眼表化学伤、重症干眼症等，几乎涵盖了所有角膜病种。角膜炎的临床病理过程可以分为四个阶段，即炎症期、溃疡期、消退期、愈合期。第一个阶段为角膜浸润期，由于致病因子形成局限性或丛簇样灰白色混浊病灶，引起眼睛明显的刺激症状和视力下降。第二个阶段是角膜溃疡形成期，炎症继续加重，病变组织发生变性、坏死、脱落，形成角膜溃疡，溃疡区角膜变薄，在眼压的作用下可以造成角膜后弹力层膨出甚至穿孔。第三个阶段是角膜炎症消退期，炎症因子被抑制了活性，溃疡边缘炎症减轻，基质坏死脱落停止，病灶逐步消退，患者自觉症状明显改善。第四个阶段是角膜炎愈合期，炎症因子被控制以后，角膜炎症病灶逐步吸收，溃疡凹面被增殖的结缔组织充填，形成疤痕。
3、脱细胞技术是当前组织工程中应用广泛的生物材料，这
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术提出一种角膜脱细胞的方法，解决上述问题。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、一种角膜脱细胞的方法：包括以下步骤：
4、步骤s1、浸泡处理：将摘取的完整的动物源性角膜置于保护液中，保护液是角膜重量的3-5倍，调整ph为7-9，温度30-50℃下浸泡3-8h；
5、步骤s2、预脱：将浸泡后角膜取出，置于脱细胞液中，角膜和脱细胞液的质量体积为1.2:(3-5)g/ml，在温度-5～-2℃下使用超声振荡处理25-35min，使上皮层脱落，使角膜前弹力层暴露；
6、步骤s3、激光脱层：将上述预脱后的角膜放入激光发生器中进行激光爆破、气化切割，去除角膜前弹力层；
7、步骤s4、气磁交联：将上述前弹力层的角膜与电磁液混合，放入离心管中，角膜与电磁液占离心管体积的1/5-1/4，往离心管内充满氮气，并用封管膜封管，在转速为4000-6000rpm下恒温振荡处理12-24h，并间断性施加脉冲磁场，即得到脱基质细胞的角膜基质；
8、步骤s5、梯度脱水：将步骤s4得到的角膜基质用质量摩尔数0.01-0.3m的nacl溶液洗涤3-5次/30min，再用质量百分比40％、60％、80％、90％、95％和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用体积比为5-10:1的甘油和水洗5-10min，得到脱细胞角膜；
9、步骤s6、辐照灭菌：将脱细胞角膜用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为5-10kgy。
10、进一步的，所述步骤s1的保护液为浓度为3-7％w/v的海藻糖溶液、0.5-5％w/v盐酸萘甲唑林水溶液，二者比值为3-5:0.3-0.9v/v。
11、进一步的，所述保护液渗透压为150-200mosm。
12、进一步的，所述步骤s2的脱细胞液的ph值为7.0-7.4，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：5-10％浓度2-5％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、12-18％中性蛋白酶、3-9％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液。
13、进一步的，所述步骤s2的超声振荡频率150-200khz，超声功率为40-60w。
14、进一步的，所述步骤s3的激光波长为1020-1040nm，重复频率为37-42mhz，平均功率为100-120w，脉冲宽度为300-500fs。
15、进一步的，所述步骤s4的电磁液为浓度为0.09-0.15mg/ml石墨烯胶体溶液。
16、进一步的，所述步骤s4的脉冲磁场强度为1.0-1.8t，磁场梯度为15-20t/m，脉冲次数100-300次，磁场频率为10-18khz，脉冲磁化时间为5-10min，每次间隔20-50s。
17、进一步的，所述步骤s4的恒温温度为35-45℃。
18、进一步的，所述动物源性角膜为小鼠、豚鼠、白兔、猫、狗、猪和牛的角膜中的任一种。
19、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
20、本专利技术使用浸泡处理、预脱、激光脱层、气磁交联、梯度脱水以及辐照灭菌对角膜进行脱细胞，得到的脱细胞角膜透光度为79.2-80.6％，完全透明，胶原纤维排列整齐，未见细胞附着，未见染色细胞及胶原断裂现象；其中浸泡处理中采用保护液对角膜后弹力层细胞保护，促进上皮层细胞渗透，并使其溶胀，再置于脱细胞液中，在低温状态下超声去除上皮层细胞，打开角膜原有胶原结构，采用激光脱层，能将前弹力层和基质层的脱细胞角膜基质层分离，通过气磁交联能对角膜基质胶原无损伤脱除；具有脱细胞完全、对角膜基质胶原无损伤、全部流程中应用的药剂均无毒性等优点，可最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞，保留其天然角膜结构特征和功能以用于组织工程人工角膜构建，是一种较为理想的组织工程角膜的支架材料。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种角膜脱细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1的保护液为浓度为3-7％w/v的海藻糖溶液、0.5-5％w/v盐酸萘甲唑林水溶液，海藻糖溶液和盐酸萘甲唑林水溶液体积比为3-5:0.3-0.9。
3.如权利要求2所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述保护液渗透压为150-200mOsm。
4.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2的脱细胞液的pH值为7.0-7.4，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：5-10％浓度2-5％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、12-18％中性蛋白酶、3-9％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液。
5.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2的超声振荡频率150-200kHz，超声功率为40-60W。
6.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S3的激光波长为1020-1040nm，重复频率为37-42MHz，平均功率为100-120W，脉冲宽度为300-5
7.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S4的电磁液为浓度为0.09-0.15mg/mL石墨烯胶体溶液。
8.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S4的脉冲磁场强度为1.0-1.8T，磁场梯度为15-20T/m，脉冲次数100-300次，磁场频率为10-18kHz，脉冲磁化时间为5-10min，每次间隔20-50s。
9.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤S4的恒温温度为35-45℃。
10.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述动物源性角膜为小鼠、豚鼠、白兔、猫、狗、猪和牛的角膜中的任一种。
...【技术特征摘要】
1.一种角膜脱细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤s1的保护液为浓度为3-7％w/v的海藻糖溶液、0.5-5％w/v盐酸萘甲唑林水溶液，海藻糖溶液和盐酸萘甲唑林水溶液体积比为3-5:0.3-0.9。
3.如权利要求2所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述保护液渗透压为150-200mosm。
4.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤s2的脱细胞液的ph值为7.0-7.4，所述脱细胞液按质量百分比计包括以下的组分：5-10％浓度2-5％w/v的水合乙二胺四乙酸三钠盐、12-18％中性蛋白酶、3-9％聚乙二醇辛基苯基醚，余量为磷酸盐缓冲溶液。
5.如权利要求1所述的角膜脱细胞的方法，其特征在于：所述步骤s2的超声振荡频率150-200khz，超声功率为40-60w。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：齐国光，湛振键，郑世鑫，李俊，董文娟，李妖娆，苏云飞，刘世豪，蔡秋雨，李旭白，
申请(专利权)人：广东康盾高新技术产业集团股份公司，
类型：发明
国别省市：
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