一种靶向CD20的嵌合受体配体及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种靶向CD20的嵌合受体配体及其应用，通过将靶向人重组CD20蛋白适配体与TACI蛋白适配体进行构建、制备，可获得HR14

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD20的嵌合受体配体及其应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤治疗
，特别涉及一种靶向CD20的嵌合受体配体及其应用。

技术介绍

[0002]CD20(B
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lymphocyte antigen CD20)，为B淋巴细胞抗原CD20，是在所有B细胞表面表达的抗原。非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin's lymphoma,NHL)，是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，发病率和病死率都居于较高值。对于肿瘤的治疗，通常采用靶向治疗就，能够起到缓解、改善肿瘤的治疗效果。靶向治疗需要靶标蛋白，CD20分子则在95％以上的B细胞淋巴瘤中特异表达，85％的非霍奇金淋巴瘤源自B细胞，因此，CD20是治疗非霍奇金淋巴瘤的理想靶点。目前，CD20尚无已知的配体，但CD20分子在B细胞的免疫应答过程中则发挥着重要的作用。
[0003]核酸适配体(aptamer)是一类短链核酸分子，以较高特异性和亲和力与靶标结合，是一类具有重大应用潜能的肿瘤靶向分子。通过构建两种特异性核酸适配体，可优异于单体核酸适配体。现有技术尚未针对CD20和TACI构建双特异性核酸适配体。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种靶向CD20的嵌合受体配体及其应用，构建、制备CD20和TACI构建双特异性核酸适配体。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]本专利技术提供一种靶向CD20的嵌合受体配体，该配体为双特异性核酸适配体；该双特异性核酸适配体由靶向人重组CD20蛋白适配体与TACI蛋白适配体构建、制备而得。
[0007]进一步说明，所述靶向人重组CD20蛋白适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]进一步说明，所述双特异性核酸适配体还嵌入短链核苷酸。
[0009]进一步说明，所述短链核苷酸长度为20nt。
[0010]进一步说明，该靶向CD20的嵌合受体配体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0011]优选地，所述肿瘤为淋巴瘤。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0013]本专利技术通过将靶向人重组CD20蛋白适配体与TACI蛋白适配体进行构建、制备，可获得HR14
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TACI特异性核酸适配体，由细胞毒性实验可知其对Daudi细胞的免疫杀伤强，细胞存活率仅约为35％，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
[0014]此外，在HR14
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TACI特异性核酸适配体中嵌入长度为20nt的核苷酸，更能增强双特异性核酸适配体对肿瘤细胞的杀伤效果，可能是嵌入的短链核苷酸避免了单体适配体之间相互影响，增强了适配体对靶细胞的亲和力，进而增强了对肿瘤细胞的杀伤效果。
附图说明
[0015]图1为ssDNA与CD20蛋白结合率；
NO.2所示。
[0030]实施例2
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双特异性核酸适配体构建、制备
[0031](1)核酸适配体HR14与TACI蛋白的构建
[0032]将核酸适配体HR14与TACI蛋白适配体，TACI蛋白适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以含有短链核苷酸Q2为引物P3、P4，含有短链核苷酸Q2为引物P3序列如SEQ ID NO.3所示，含有短链核苷酸Q2为引物P4序列如SEQ ID NO.4所示，短链核苷酸Q2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，长度为20nt，利用高保真酶进行PCR重叠扩增，取PCR产物，以pCZN1质粒为载体，将反应产物转化DH5a感受态细胞，进行PCR菌落筛选鉴定阳性克隆。以未含有短链核苷酸Q2为引物P5、P6，未含有短链核苷酸Q2为引物P5序列如SEQ ID NO.5所示，未含有短链核苷酸Q2为引物P6序列如SEQ ID NO.6所示，获得的克隆为对比样品。
[0033]取阳性克隆菌液和对比样品，以含有EcoRI限制性核酸内切酶酶切位点的引物P7、P8，以含有EcoRI限制性核酸内切酶酶切位点的引物P7序列如SEQ ID NO.7所示，以含有EcoRI限制性核酸内切酶酶切位点的引物P8序列如SEQ ID NO.8所示，利用高保真酶进行PCR扩增，凝胶电泳，回收DNA片段。
[0034](2)HR14
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TACI特异性核酸适配体的制备
[0035]使用HindIlI限制性核酸内切酶对pUC118质粒进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳后，回收DNA片段，加入酶切产物，采用同源重组试剂盒将酶切产物同源片段与切割回收的载体DNA混合，进行重组反应，将反应产物转化DH5a感受态细胞，冰上放置15min，42℃水浴热激30s，冰上放置3min，加入LB培养基，37℃、200r/min培养1h，涂布至LB固体培养基(含有IPTG诱导剂，卡那霉素)，37℃过夜培养。而后进行PCR菌落筛选鉴定阳性克隆。
[0036]取阳性克隆菌液，加入LB培养基(含有卡那霉素)，37℃过夜培养，以8000r/min离心5min，弃去上清液，加入裂解液使菌体裂解，8000r/min离心5min，取上清液，提取DNA，加入MC1061感受态细胞，冰上放置15min，42℃水浴热激30s，冰上放置3min，加入LB培养基，37℃、200r/min培养1h，涂布至LB固体培养基(含有卡那霉素)，37℃过夜培养。而后进行PCR菌落筛选鉴定阳性克隆。
[0037]取阳性克隆菌液，接种LB液体培养基(含卡那霉素)，37℃，220r/min培养至OD600值为0.4～0.5，加入VCSM13噬菌体，37℃，220r/min培养2h，加入卡那霉素，37℃，220r/min过夜培养，8000r/min离心5min，取上清液，采用PEG沉淀噬菌体，收集和裂解噬菌体，提取DNA，加入EcoRI限制性核酸内切酶，凝胶电泳，回收DNA片段，纯化，得HR14
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TACI特异性核酸适配体和HR14
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TACI特异性核酸适配体对比样品。
[0038]实施例3
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特异性核酸适配体体外抗肿瘤的作用
[0039]靶细胞选用Daudi细胞，每孔细胞密度为5
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105个；效应细胞选用PBMC细胞(PB009C
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2)，效靶比E：T为5：1，杀伤时间为48h。
[0040]实验组设置：以加入HR14
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TACI特异性核酸适配体和PBMC细胞培养液，为实验组1；以加入HR14
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TACI特异性核酸适配体对比样品和PBMC细胞培养液，为实验组2；以加入HR14适配体和PBMC细胞培养液，为实验组3；以加入TACI适配体和PBMC细胞培养液，为实验组4；以加入HR14
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TACI特异性核酸适配体，为对比组1；以加入PBMC细胞培养液，为对比组2。
[0041]采用MTS细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒测定细胞存活率，计算公式：细胞存活率本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD20的嵌合受体配体，其特征在于，所述配体为双特异性核酸适配体；所述双特异性核酸适配体由靶向人重组CD20蛋白适配体与TACI蛋白适配体构建、制备而得。2.根据权利要求1的一种靶向CD20的嵌合受体配体，其特征在于，所述靶向人重组CD20蛋白适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭大为，湛振键，郑世鑫，刘世豪，
申请(专利权)人：广东康盾高新技术产业集团股份公司，
类型：发明
国别省市：