一种夹心法检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白的核酸适体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够用于检测SARS

【技术实现步骤摘要】
一种夹心法检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2核衣壳蛋白的核酸适体及其应用


[0001]本专利技术属于医药领域和生物
，涉及一种核酸适体的X
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aptamer蛋白筛选及其应用，具体是涉及一种可用于新型冠状病毒SARS
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CoV
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2 核衣壳蛋白检测的核酸适体筛选及其用途方法。

技术介绍

[0002]冠状病毒最早发现于鸟类和哺乳动物，是一类有包膜的单股正链RNA病毒，冠状病毒科包括两个亚科，莱托韦亚科和正冠状病毒亚科。正冠状病毒包括四个属:α、β、γ和δ冠状病毒。在过去近20年中，世界上曾有3次较大规模的人类冠状病毒流行，包括2003年暴发的严重急性呼吸综合征 (SARS)、2012 年暴发的中东呼吸综合征(MERS) 和近期暴发的新型冠状病毒肺炎 (COVID
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19)。这3种冠状病毒疾病的病毒都属于β冠状病毒，且传染性和致病性较强。电镜下观察 SARS
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2 病毒颗粒一般呈球形，直径为 60
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140nm。成熟的SARS
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2 病毒颗粒有4种结构蛋白，包括结合基因组 RNA 形成核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白、参与包膜形成的小包膜（envelop，E）蛋白、包膜（membrane，M）蛋白以及位于包膜表面形成刺状突起的 S 蛋白。
[0003]在SARS
‑/>CoV
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2的四个主要结构蛋白中，N蛋白被认为具有高度的免疫原性，其分子质量约为48 KDa，在病毒感染过程中大量表达是含量最丰富的蛋白而且其碱基序列非常保守。根据世界卫生组织的报道，所有SARS
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2变体都包含至少一种突变，其中超过50%位于N蛋白的7个氨基酸(N: 199
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205)内，冠状病毒的N蛋白具有免疫原性，在病毒基因组包装、胞内蛋白运输、DNA降解、干扰宿主翻译、限制宿主免疫反应等方面发挥着重要作用。SARS
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2的N蛋白主要由5个结构域组成，包括由氨基酸残基1
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40编码的N端尾结构域、N
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末端结构域由残基41
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173编码的NTD、残基174
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249编码的富含Ser/Arg的链接区LKR、残基250
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364编码的c端二聚结构域N
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CTD和残基365
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419编码的c端IDR。
[0004]通过对SARS
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2患者的血清进行研究，结果表明其N蛋白可作为SARS
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2的有效诊断标志物。与其他冠状病毒N蛋白相似，SARS
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2 的N蛋白可以大量触发SARS
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2患者的早期抗体反应，从而使N蛋白成为开发特异性免疫检测的有效靶点。临床研究发现SARS
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2 N蛋白可在患者血清中检测，其特异性和敏感性可以达到97%和92%，表明检测新型冠状N蛋白，对新型冠状病毒准确、及时诊断具有重要价值，为国家疫情防控带来正向的意义。
[0005]核酸适体是通过指数富集配基的系统进化技术（SELEX）筛选得到的寡核苷酸单链，其能够通过分子内折叠形成特定的三维结构。正是由于核酸适体具有多样的结构，从而使其具有高亲和性、强特异性以及靶标分子多样等特点。目前核酸适体在体内分子成像、靶标探究及药物开发等方面展现了广阔的应用前景。核酸适体又称为“化学抗体”，但是与常规蛋白抗体相比，具有以下优势：（1）可以通过化学方法快速合成、成本低及周期短；（2）一般是一段单链的寡聚核苷酸，对其进行修饰简单，且也不影响生物活性，如在其一端修饰巯
基、生物素、氨基及羧基等用于固定，修饰一些电活性、光活性物质或酶都非常成熟；（3）特异性高，识别能力强，由于其与其靶分子有很大的接触面积，能够分辨出靶分子结构上的细微差别，即使靶分子上有一个官能团的差异也能区分开来；（4）性质稳定，分子结构简单，应用于传感界面，再生比抗体容易。不容易受外界环境条件的影响，例如pH，盐离子浓度，温度等因素。因此相比抗体的研究与应用，核酸适体其具备有与抗体相似的识别功能，针对新型冠状病毒也能够特异性识别，具有巨大的应用潜力。
[0006]因此，针对新型冠状病毒SARS
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2 核衣壳蛋白筛选得到结合亲和力高的核酸适体，开发出一种快速诊断方法，对新冠病毒的检测具有重要的意义，给国家疫情防控带来积极的作用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种具有小分子量、稳定的化学性质、保存简单且特异性结合SARS
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2 核衣壳蛋白等优良特性的核酸适体及其针对SARS
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CoV
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2 核衣壳蛋白制备双核酸适体夹心法试剂盒。
[0008]本专利技术主要通过X
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aptamer蛋白筛选技术获得两条针对SARS
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2 核衣壳蛋白的核酸适体。其序列分别为：5
ꢀ′‑
AACACGACCGGACTGTGGGGGTCACAGAGTGGGCGAGTCGTG
‑3′
和5
ꢀ′‑
AACACGACTCTCCTGTGGCCAGCGAACTGATTGCCTGTCGTG
‑3′
。这两条识别SARS
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2 核衣壳蛋白的核酸适体，均具有42个碱基的核酸序列，主要通过表面等离子共振（SPR）检测其与目的蛋白的相互作用情况。简单描述为：将SARS
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2 核衣壳蛋白固定在生物传感器表面，再将挑选的核酸单链溶液注入生物传感器的表面。通过蛋白与核酸适体间的相互作用引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，则可以反映出蛋白与核酸适体之间反应的变化，通过传感器的信号进行判断挑选的核酸适体与SARS
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2核衣壳蛋白的结合强弱情况。
[0009]本专利技术是基于X
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aptamer蛋白筛选技术，以SARS
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2 核衣壳蛋白为筛选样本进行两轮筛选。从筛选结果序列中，通过测序几百万总量的核酸序列，满足处于不同的进化树家族中的条件，从中选取排序前100条的候选序列。后续挑选其中50条核酸适体，通过SPR实验初步检测了这些候选序列的结合能力，最终进一步通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸适体，其特征在于，所述核酸适体可特异性结合SARS
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CoV
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2 核衣壳蛋白，其核苷酸序列选自为：NP4：5
ꢀ′‑
AACACGACCGGACTGTGGGGGTCACAGAGTGGGCGAGTCGTG
‑3′
或NP14：5
′‑
AACACGACTCTCCTGTGGCCAGCGAACTGATTGCCTGTCGTG
‑3′
。2.根据权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，还包括对核酸适体的修饰，进一步地，所述标记修饰是指在核酸适体连接上荧光基团、化学基团、放射性物质、治疗性物质或者酶。3.一种检测或鉴别SARS
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2 核衣壳蛋白或诊断SARS
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2的双核酸适体夹心法试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的核酸适体中的两种。4.根据权利要求3的试剂盒，其特征在于，还包括链霉亲和素化的辣根过氧化物酶、新型冠状病毒核衣壳重组蛋白、封闭液、TMB显色液及终止液；更进一步地，还包括新型冠状病毒核衣壳重组蛋白。5.根据权利要求4的试剂盒，其特征在于，先将所述的NP4或NP14核酸适体与原待检样品进行孵育，再加入标记修饰的另一条核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡小晓，周舒，徐钰熙，欧海龙，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：