两种产阿魏酸酯酶的菌株制造技术

本发明专利技术公开了从白酒大曲中分离得到的两种产阿魏酸酯酶的菌株，具体是屎肠球菌L

【技术实现步骤摘要】
两种产阿魏酸酯酶的菌株


[0001]本专利技术涉及生物工程
，涉及两种产阿魏酸酯酶的菌株，具体是屎肠球菌L
‑
7和伯克霍尔德氏菌BK100。

技术介绍

[0002]大曲是中国白酒酿造中的糖化发酵剂，富含微生物、水解酶和风味物质。大曲能够为白酒酿造提供稳定的微生物菌群，还能为微生物的生长提供营养。同时大曲中的多种微生物产生的生物酶，有助于白酒发酵过程中原料的分解。大曲在白酒发酵中起着关键性的作用，“曲为酒之骨”，优质的酒曲是生产出优质白酒的重要前提。大曲中的微生物和其产生的生物酶，为曲酒的后续生产提供重要保障，对形成各种香型白酒自身特有的风格也具有重要的影响。
[0003]阿魏酸(Ferulic acid)是一种酚酸类物质，阿魏酸具有较强的抗氧化、抗辐射、防治冠心病和抑制肝损伤等作用，广泛应用于医药、化妆品、食品等行业。阿魏酸作为一种有机酚酸，有较强的呈香作用，是酒中呈香物质之一。阿魏酸还可作为酒中香味的前体物质，在微生物的作用下可转变成香草醛、4
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EG、4
‑
乙烯基愈创木酚等香味成分，为形成白酒独特的风格作出重要贡献。阿魏酸广泛存在于植物细胞壁，与多糖、木质素间以醚键或酯键形成网状结构，限制了纤维素的利用和微生物对于植物纤维类材料的降解。
[0004]阿魏酸酯酶(Feruloy esterase)属于羧酸酯酶亚类，可催化水解阿魏酸与多糖、纤维素、木质素间的酯键或醚键，生成阿魏酸。阿魏酸酯酶也可用于酯类物质的合成，如羟基肉桂酸酯等。真菌、细菌和酵母菌都能分泌阿魏酸酯酶。不同来源的阿魏酸酯酶其酶学性质、序列同源性、空间结构有较大差异。目前已报道的阿魏酸酯酶主要来源于微生物，但从中分离得到的阿魏酸酯酶酶活力普遍较低，微生物菌株主要是从土壤、海水、人和动物的肠道中筛选得到的，从白酒酿造原料中筛选出产阿魏酸酯酶的菌株相对较少。阿魏酸酯酶在食品、饲料、医药、造纸、纺织等诸多领域中具有广泛的应用价值，其应用于白酒酿造过程中，可以加快原料细胞壁的降解，使大曲中的微生物转化反应更迅速、彻底。此外，在白酒酿造过程中，随着发酵的进行，发酵体系内酸度、乙醇浓度逐渐升高，大多数商业菌种不能耐受高酸、高乙醇浓度等不利条件。
[0005]目前，对比文件(CN109468232A)公开了一种产阿魏酸酯酶的谢瓦散囊菌及其在白酒大曲生产中的应用。已有研究显示屎肠球菌广泛存在于发酵食品中，不仅对食品的香气、风味、质地产生影响，还具有调节肠道菌群、提高机体免疫力等益生作用，但没有其产阿魏酸酯酶及阿魏酸的报道。
[0006]另外，已检索到伯克霍尔德氏菌可产脂肪酶、ACC脱氨酶、纤维素酶，但没有其产阿魏酸酯酶的报道，目前已检索到授权公告号CN109468232A的专利，该技术公开了一株从大曲中分离的可以产阿魏酸酯酶的菌株，并将该菌的菌粉按比例加到白酒大曲生产中。检索到授权公告号为CN113308424A的专利，该技术公开了一种产阿魏酸酯酶的短小芽孢杆菌发酵产阿魏酸酯酶在45℃
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60℃仍能保持80％以上的酶活力。然而上述现有技术未提及筛选
出的菌在酿造过程中是否仍适于生长，也未曾提及产阿魏酸酯酶的菌株的粗酶液的测定条件优化与应用。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供两种产阿魏酸酯酶的菌株。屎肠球菌L
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7具有耐酸碱、耐盐、耐乙醇等特性，可用于白酒酿造过程中，提高白酒中阿魏酸的含量，增强白酒保健功能，而伯克霍尔德氏菌BK100具有耐高温、耐碱的特点，适用于进行后期高产阿魏酸代谢工程改造。
[0008]本专利技术的技术目的通过以下技术方案实现：
[0009]第一方面，提供了两种产阿魏酸酯酶的菌株，具体是屎肠球菌L
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7和伯克霍尔德氏菌BK100；所述屎肠球菌L
‑
7保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M20221555，保藏日期为2022年10月10日；所述伯克霍尔德氏菌BK100保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221553，保藏日期为2022年10月10日。
[0010]进一步的，所述伯克霍尔德氏菌BK100温度耐受范围为20
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57℃，且在25
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40℃生长良好，其最适生长温度为30℃。
[0011]进一步的，所述屎肠球菌L
‑
7的pH耐受性为pH 4～11，在pH 7～10生长良好，在pH 8时菌株生长繁殖最快。
[0012]进一步的，所述屎肠球菌L
‑
7在NaCl浓度1％～3％，乙醇浓度1％～7％范围内可以正常生长。
[0013]更进一步的，所述屎肠球菌L
‑
7在NaCl浓度2％，乙醇浓度5％时生长良好。
[0014]第二方面，所述屎肠球菌L
‑
7的筛选过程包括下述内容：
[0015]一)采样：从成品大曲的各个角及中心部位各取10g样品，磨碎混合均匀，得大曲样品；
[0016]二)富集：称取2g步骤一)得到的大曲样品，装入250mL三角瓶中，加入100mL无菌生理盐水，摇匀，在37℃、180r/min条件下摇床培养30min，制成菌悬液；
[0017]三)筛选：用无菌生理盐水对步骤2)制成的菌悬液进行系列梯度稀释，分别取100μL稀释倍数为10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6的菌悬液，在筛选培养基上进行涂布，每个梯度做三个平行，将涂布好的培养皿在37℃培养箱中，倒置培养72h；
[0018]四)纯化：观察筛选培养基上的菌落及透明圈大小，挑取透明圈较大的菌落在LB固体培养基上划线，在37℃培养箱中培养24h，重复三次，得到目的菌株的单菌落；将获得的单菌落接种于LB液体培养基中，培养过夜。取1ml菌液接种于发酵培养基中，培养72h，结束发酵，离心取上清液，过滤膜到液相小瓶中，用高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸含量，将产阿魏酸酯酶的菌株保藏于甘油管中；
[0019]其中，步骤三)和四)中筛选培养基为：硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，超纯水1L，121℃灭菌20min；冷却至70℃左右添加1.5％(v/v)的阿魏酸乙酯(10％W/V溶于N，N
‑
二甲基甲酰胺溶液，通过0.22um无菌滤膜过滤除菌)；
[0020]步骤四)中LB固体培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，超纯水1L，pH自然，121℃，灭菌20min；
[0021]步骤四)中LB液体培养基为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，超纯水1L，pH自然，121℃，灭菌20min；
[0022]步骤四)中发酵培养基：麦麸10g/L，酵母提取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产阿魏酸酯酶的屎肠球菌L
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7，其特征是，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M 20221555，保藏日期为2022年10月10日。2.一种耐高温伯克霍尔德氏菌BK100，其特征是，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221553，保藏日期为2022年10月10日。3.根据权利要求1所述的一种产阿魏酸酯酶的屎肠球菌L
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7，其特征是，所述屎肠球菌L
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7的pH耐受性为pH 4～11，在pH 7～10生长良好，在pH 8时菌株生长繁殖最快。4.根据权利要求1所述的一种产阿魏酸酯酶的屎肠球菌L
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7，其特征是，所述屎肠球菌L
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7在NaCl浓度1％～3％，乙醇浓度1％～7％范围内可以正常生长。5.根据权利要求4所述的一种产阿魏酸酯酶的屎肠球菌L
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7，其特征是，所述屎肠球菌L
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7在NaCl浓度2％，乙醇浓度5％时生长良好。6.一种如权利要求1所述的产阿魏酸酯酶的屎肠球菌L
‑
7的筛选方法，其特征是，包括以下步骤：一)采样：从成品大曲的各个角及中心部位各取10g样品，磨碎混合均匀，得大曲样品；二)富集：称取2g步骤1)得到的大曲样品，装入250mL三角瓶中，加入100mL无菌生理盐水，摇匀，在37℃、180r/min条件下摇床培养30min，制成菌悬液；三)筛选：用无菌生理盐水对步骤2)制成的菌悬液进行系列梯度稀释，分别取100μL稀释倍数为10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6的菌悬液，在筛选培养基上进行涂布，每个梯度做三个平行，将涂布好的培养皿在37℃培养箱中，倒置培养72h；四)纯化：观察筛选培养基上的菌落及透明圈大小，挑取透明圈较大的菌落在LB固体培养基上划线，在37℃培养箱中培养24h，重复三次，得到目的菌株的单菌落；将获得的单菌落接种于LB液体培养基中，培养过夜。取1ml菌液接种于发酵培养基中，培养72h，结束发酵，离心取上清液，过滤膜到液相小瓶中，用高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸含量，将产阿魏酸酯酶的菌株保藏于甘油管中；其中，筛选培养基：硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，超纯水1L，121℃灭菌20min；冷却至70℃左右添加1.5％(v/v)的阿魏酸乙酯(10％W/V溶于N，N
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二甲基甲酰胺溶液，通过0.22um无菌滤膜过滤除菌)；LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，超纯水1L，pH自然，121℃，灭菌20min；LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，超纯水1L，pH自然，121℃，灭菌20min；发酵培养基：麦麸10g/L，酵母提取物1g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，超纯水1L，pH自然，121℃，灭菌20min，七水硫酸镁单独灭菌后加入培养基中。7.一种如权利要求1所述的屎肠球菌L
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7在发酵生产阿魏酸酯酶中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述屎肠球菌L
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7发酵生产...

【专利技术属性】
技术研发人员：童文华，李佳伟，何萍，黄志久，王洪禹，车经纬，黄丹，罗惠波，
申请(专利权)人：醉清风酒业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：