一种特异性识别黄曲霉毒素B1的适配体及其优化方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性识别黄曲霉毒素B1的适配体及其优化方法，属于生物技术领域。所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；且所述适配体的筛选方法为：用生物信息学分析适配体和黄曲霉毒素B1(AFB1)的结合机制，同时在分子对接辅助下对适配体序列进行裁剪，最后通过亲和力实验筛选出亲和力高的适配体。本发明专利技术可以清晰地获得与靶标结合相关的适配体核心序列，提高工作效率和节约成本，最终获得了只有34个核苷酸序列且是初始适配体5.2倍的高亲和力适配体。亲和力适配体。亲和力适配体。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别黄曲霉毒素B1的适配体及其优化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种特异性识别黄曲霉毒素B1的适配体及其优化方法。

技术介绍

[0002]近年来，适配体以其高亲和力和特异性在疾病诊断和治疗、药物输送、食品安全检测、环境监测等领域引起了国际社会的广泛关注。在食品安全检测中，基于适配体的生物传感技术可用于霉菌毒素检测。适配体是适配体生物传感器的核心组成部分，通常是一个短的单链寡核苷酸(DNA或RNA)序列，长度约为30
‑
80个碱基。当适配体与待测物质特异性结合时，它会在各种力量的作用下发生构象变化，是抗体的理想替代品，并且在很多方面表现优于抗体。将适配体应用于食品及其制品中霉菌毒素的检测，有望实现对食品及其制品中霉菌毒素的准确监测，从而减少霉菌毒素污染造成的损失。
[0003]适配体是通过SELEX技术从随机DNA或RNA文库中体外筛选出来的合成寡核苷酸序列。经典的SELEX技术，主要包括孵化、结合、洗脱、扩增和调节五个步骤。值得注意的是，通过SELEX技术筛选出来的初始适配体序列包含着与靶标物结合的关键序列，但也存在着部分不参与结合的多余序列，多余序列不参与与靶标物的结合，更甚者可能与随机序列发生碱基配对从而影响随机序列与靶标物的结合，使其亲和力特异性降低。并且在实际应用中，霉菌毒素的生存环境复杂，往往伴随着多种毒素及其衍生物共存的情况。此外，只有适配体部分的特定碱基与待测物质发生构象变化。较长的起始适配体序列可能存在较大的位阻，不利于适配体与靶标之间形成稳定的空间结构，从而导致适配体特异性和稳定性降低、合成成本增加。因此，仅通过SELEX技术筛选鉴定的霉菌毒素适配体的抗干扰性和选择性在实际应用中并不能令人满意，对适配体序列进行POST
‑
SELEX将是一种很有前景的策略。
[0004]POST
‑
SELEX是获得具有可靠亲和力和低成本的真正实用适配体的关键步骤。在POST
‑
SELEX中，最典型的策略是碱基截短，直接应用这种策略的试错性较大，会耗费过多的精力及其财力，并且有可能导致所开发的适配体特异性降低。适配体截短通过切断适配体序列中不需要的片段，可以有效降低合成成本，提高适配体的应用价值。生物信息学是一种比较直观的理论模拟方法，利用计算机技术进行三维建模并模拟适配体和靶标物的结合过程，基于分子间作用力及空间结构，研究并预测适配体与靶标物结合机制以及关键作用位点。通过生物信息学辅助得到的信息对适配体序列后优化有着重要作用，可以根据结构分析和结合位点预测进行适当的截短，直到找到最短的适配体序列。
[0005]基于以上问题，本专利技术在生物信息学辅助下分析适配体和黄曲霉毒素B1(AFB1)的结合机制，并通过分子对接辅助对序列截短优化能够获得高亲和力适配体。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种特异性识别黄曲霉毒素B1的适配体及其优化方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种特异性识别黄曲霉毒素B1的适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0009]5’‑
GGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTT
‑3’
，SEQ ID NO.1。
[0010]本专利技术提供一种特异性识别黄曲霉毒素B1的适配体的优化方法：
[0011](1)构建初始适配体二级结构、三级结构及AFB1的三级结构；
[0012](2)对初始适配体三级结构进行动力学优化；
[0013](3)分子对接及构象分析：
[0014]以优化后的初始适配体三级结构为受体，步骤(1)中AFB1三级结构为配体，对受体和配体进行分子对接，获得AFB1
‑
初始适配体，并对Grid_score值排名前4的AFB1
‑
初始适配体进行构象分析，得到AFB1
‑
初始适配体重要结合位点；
[0015](4)构建AFB1
‑
裁剪适配体：
[0016]根据得到的重要结合位点对步骤(1)中初始适配体的核苷酸序列进行裁剪，以裁剪后的适配体三级结构作为受体，构建的AFB1三级结构作为配体，对受体和配体进行分子对接，形成AFB1
‑
裁剪适配体；
[0017](5)亲和力测定：
[0018]从步骤(4)中选取Grid_score值排名前三的AFB1
‑
裁剪适配体进行亲和力测定，获得亲和力高的适配体；
[0019]进一步地，所述步骤(1)中初始适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
[0020]5’‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA
‑3’
，SEQ ID NO.2；
[0021]进一步地，所述步骤(2)中动力学优化要经过最小化处理、热处理、平衡处理，最小化处理的处理参数为5000steps、5000steps、20000steps，热处理的处理参数为0
‑
300K，平衡处理的处理参数为200ps,1ns，其他值为默认值，最后在42000ps MD下模拟；
[0022]进一步地，所述步骤(2)中动力学优化选取稳定结构中最后一帧的结构作为最终三级结构；
[0023]进一步地，所述步骤(5)中亲和力测定需要在裁剪适配体的5
’
端修饰FAM基团。
[0024]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：本专利技术通过生物信息学分析了适配体和AFB1的结合机制。同时在分子对接辅助下进行序列截短优化实验，可以清晰地获得与靶标结合相关的适配体核心序列，提高工作效率和节约成本，最终获得了亲和力是初始适配体5.2倍的高亲和力适配体。本专利技术不仅获得了针对AFB1的最佳适配体，为其实际应用奠定了基础，也为适配体的优化提供了良好的参考。同时，本专利技术中使用的选择和截断方法可能对优化不同目标的稳定、低成本和高亲和力适配体提供一种有效且通用的策略。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0026]图1附图为初始适配体二级结构、三级结构及AFB1三级结构的建立，其中图A为初
始适配体二级结构，图B是初始适配体三级结构，图C是AFB1结构式，图D是AFB1三级结构；
[0027]图2附图为动力学优化结果，其中图A是初始适配体在42000ps下的RMSD，图B是MD后初始适配体的三级结构；
[0028]图3附图为A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别AFB1的适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种特异性识别AFB1的适配体的优化方法，其特征在于，步骤如下：(1)构建初始适配体二级结构、三级结构及AFB1的三级结构；所述初始适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；(2)优化构建的初始适配体三级结构；(3)分子对接及构象分析：对AFB1三级结构与优化后的初始适配体三级结构进行分子对接，获得AFB1
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初始适配体，并对Grid_score值排名前4的AFB1
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初始适配体进行构象分析，得到AFB1
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初始适配体的重要结合位点；(4)构建AFB1
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裁剪适配体：根据得到的重要结合位点对步骤(1)中的初始适配体的核苷酸序列进行裁剪，对裁剪后的适配体和AF...

【专利技术属性】
技术研发人员：于寒松，范怡婷，杨欢欢，吕博，景文丹，王祎，王珺瑶，宫皓，陈雪，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：