一种人凝血X因子的DNA适配体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物材料领域，具体涉及一种人凝血X因子的DNA适配体及其应用。本发明专利技术的目的在于提供一种人凝血X因子的DNA适配体，以解决RNA适配体虽然通过修饰提高了其血浆稳定性，但价格十分昂贵的问题。本发明专利技术的技术方案是一种人凝血X因子的DNA适配体，所述DNA适配体为单链核酸，通过形成特定的二级结构特异性地与人凝血X/Xa因子结合，从而阻碍凝血过程的发生，在体外表现出了良好的抗凝活性。在体外表现出了良好的抗凝活性。在体外表现出了良好的抗凝活性。

【技术实现步骤摘要】
一种人凝血X因子的DNA适配体及其应用


[0001]本专利技术属于生物材料领域，具体涉及一种人凝血X因子的DNA适配体及其应用。

技术介绍

[0002]核酸适配体通常是通过指数富集的配体进化技术(SELEX技术)从特定的寡核苷酸文库中筛选出来的核糖核酸/脱氧核糖核酸分子，对靶标具有高特异性和高亲和力。
[0003]在凝血级联反应中，凝血因子按照一定顺序被激活，最终使纤维蛋白原转变为纤维蛋白。核酸适配体对靶标具有高亲和力，可通过与靶标蛋白结合而抑制蛋白的功能。基于此，已经开发了诸多凝血因子的核酸适配体用于发挥凝血作用。
[0004]凝血X/Xa因子参与了共同凝血途径，在凝血级联中发挥着至关重要的作用。与DNA相比，RNA的血浆稳定性差，价格贵。人凝血X/Xa因子(HFX/HFXa)的RNA适配体虽然通过修饰提高了其血浆稳定性，但价格十分昂贵。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种人凝血X因子的DNA适配体，以解决RNA适配体虽然通过修饰提高了其血浆稳定性，但价格十分昂贵的问题。
[0006]本专利技术的技术方案是一种人凝血X因子的DNA适配体，所述DNA适配体为单链核酸，能形成特定的二级结构。
[0007]具体的，所述DNA适配体为Apt
‑
1s(SEQ ID No.8)或/和Apt
‑
3s(SEQ ID No.9)。
[0008]进一步的，所述DNA适配体为Apt
‑
1(SEQ ID No.1)、Apt
‑
3(SEQ ID No.2)、Apt
‑
4(SEQ ID No.3)、Apt
‑
5(SEQ ID No.4)、Apt
‑
12(SEQ ID No.5)、Apt
‑
18(SEQ ID No.6)或Apt
‑
43(SEQ ID No.7)中的至少一个。
[0009]SEQ ID No.1Apt
‑
1单链核酸(76nt)：
[0010]TTCAGCACTCCACGCATAGCCCTATGGGTAGGAAGAGGGATCTTGGCTGGGATGCTCCTATGCGTGCTACCGTGAA；
[0011]SEQ ID No.2Apt
‑
3单链核酸(76nt)：
[0012]TTCAGCACTCCACGCATAGCCCTATGGGTAGGAAGAGGGATCTTGGCTGGGATGTTCCTATGCGTGCTACCGTGAA；
[0013]SEQ ID No.8Apt
‑
1s单链核酸(52nt)：
[0014]CGCATAGCCCTATGGGTAGGAAGAGGGATCTTGGCTGGGATGCTCCTATGCG；
[0015]SEQ ID No.9Apt
‑
3s单链核酸(52nt)：
[0016]CGCATAGCCCTATGGGTAGGAAGAGGGATCTTGGCTGGGATGTTCCTATGCG。
[0017]特别的，所述DNA适配体的退火缓冲液为：20mM(4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸)(HEPES)，150mM氯化钠，2mM氯化钙，pH 7.4。
[0018]进一步的，所述DNA适配体的退火程序为：95℃孵育5min，65℃孵育30min，50℃孵育30min，37℃孵育30min，25℃孵育30min，4℃孵育2h以上；或者95℃孵育10min，冰上孵育
5min，室温孵育5min以上。
[0019]本专利技术还提供了所述人凝血X因子的DNA适配体的解毒剂，其核苷酸序列如SEQ ID No.12～14任一项所示。
[0020]SEQ ID No.12AO
‑
1单链核酸(28nt)：CCTCTTCCTACCCATAGGGCTATGCGTG
[0021]SEQ ID No.13AO
‑
2单链核酸(26nt)：CCCAGCCAAGATCCCTCTTCCTACCC
[0022]SEQ ID No.14AO
‑
3单链核酸(11nt)：TCTTCCTACCC
[0023]本专利技术还提供了所述人凝血X因子的DNA适配体在凝血途径中的用途。
[0024]本专利技术还提供了所述人凝血X因子的DNA适配体在抗凝中的用途。
[0025]本专利技术还提供了所述解毒剂在凝血途径中的用途。
[0026]进一步的，在所述用途中，解毒剂与DNA适配体的用量摩尔比1︰1。
[0027]本专利技术的有益效果：血浆稳定性研究表明所述的DNA适配体不易被核酸酶降解，具有在血浆中发挥作用的基础；抗凝实验表明，所述的DNA适配体在内源性凝血途径和外源性凝血途径中以浓度和时间依赖性的方式发挥了抗凝作用；利用碱基互补配对的原则，设计所述DNA适配体的解毒剂能够逆转部分抗凝活性。本专利技术所述的DNA适配体是以人凝血X因子为靶标，采用SELEX技术经过多轮筛选得到的。所述的DNA适配体能够通过与人凝血X/Xa因子结合，阻碍人凝血X/Xa因子与其他凝血因子的结合位点，从而阻碍凝血过程的发生，在体外表现出了良好的抗凝活性，其发挥抗凝作用呈浓度和时间依赖性。所述DNA适配体的解毒剂能够逆转部分抗凝活性。所述的DNA适配体及其解毒剂血浆稳定性好，价格相对便宜，易于合成，易于储存。本专利技术可为临床抗凝提供一种新的思路。基于本专利技术所述的DNA适配体，可考虑与凝血X/Xa因子上下游的抑制剂联用，以发挥“1+1>2”的抗凝效果。
附图说明
[0028]图1、HFX的DNA适配体筛选流程图。
[0029]图2、流式细胞术监测筛选终点；control为对照，selex2、6、10、15、16分别为相应筛选轮数制备得到的文库。
[0030]图3、Mfold预测各候选适配体(Apt
‑
1、Apt
‑
3、Apt
‑
4、Apt
‑
5、Apt
‑
12、Apt
‑
18、Apt
‑
43)的二级结构，预测条件设置为150mM氯化钠，25℃。
[0031]图4、8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳考察候选适配体与HFX的结合；Marker为25～500bp的DNA分子量标准，Apt表示适配体，HFX为人凝血X因子，Oligomer为适配体自身形成的低聚体。
[0032]图5、流式细胞术考察候选适配体与HFX的结合；Relative Fluorescence Intensity表示相对荧光强度，control为对照。
[0033]图6、Mfold预测截短后DNA适配体(Apt
‑
1s、Apt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人凝血X因子的DNA适配体，其特征在于，所述DNA适配体为单链核酸，退火形成特定的二级结构。2.如权利要求1所述的DNA适配体，其特征在于，所述DNA适配体为Apt
‑
1s(SEQ ID No.8)或Apt
‑
3s(SEQ ID No.9)。3.如权利要求3所述的DNA适配体，其特征在于，所述DNA适配体为Apt
‑
1(SEQ ID No.1)、Apt
‑
3(SEQ ID No.2)、Apt
‑
4(SEQ ID No.3)、Apt
‑
5(SEQ ID No.4)、Apt
‑
12(SEQ ID No.5)、Apt
‑
18(SEQ IDNo.6)或Apt
‑
43(SEQ ID No.7)中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘斌，杜潇，唐利，余霜，左华，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：