一种长单链DNA及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种长单链DNA，所述DNA长单链含有TfR适配体和Tau适配体。制备方法包括以下步骤：第一步、将磷酸化DNA模板与DNA引物混合在NaCl溶液中，所述DNA模板包含TfR适配体和Tau适配体；第二步、将第一步所得的混合物进行热循环；第三步、退火后，加入T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液16℃下孵育过夜，然后加热到65℃保持10分钟，使T4DNA连接酶失活，得到环状DNA模板；第四步、环状DNA模板与dNTPs和phi29DNA聚合酶依次加入RCA反应缓冲液中，置于30℃反应2h，即得长单链DNA。所述长单链DNA应用于阿尔茨海默症(AD)的治疗干预。本申请通过引入TfR适配体和Tau适配体，通过滚环扩增的方法合成含多价适配体的DNA长单链，能够更精准有效的治疗Tau蛋白病介导的AD。准有效的治疗Tau蛋白病介导的AD。准有效的治疗Tau蛋白病介导的AD。

【技术实现步骤摘要】
一种长单链DNA及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及阿尔茨海默症(AD)治疗领域，尤其是一种长单链DNA及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]AD是一种以记忆丧失和认知障碍为特征的进行性神经退行性疾病，是痴呆症最常见的形式，威胁着全世界数百万人的生命。AD的两个主要特征是高水平的活性氧(ROS)和细胞内Tau蛋白神经纤维缠结(NFTs)。正常的Tau蛋白在神经元轴突中含量丰富，可以与微管结合并稳定其结构。然而，在病理环境中，Tau蛋白经历异常的翻译后修饰，如过度磷酸化和截断，然后组装成NFTs，导致神经元死亡和突触功能障碍。
[0003]目前，很多Tau蛋白磷酸化抑制剂在一定程度上缓解了疾病的发展，但其效果并不理想，很大程度上是因为大部分游离药物无法有效到达大脑发挥正常作用。首先，它们的固有缺陷，如生物稳定性差，半衰期短，严重丧失了治疗效果。其次，血脑屏障是限制许多治疗性抗体和候选药物运输的主要障碍。为了取得令人满意的临床结果，必须克服这些限制。
[0004]适配体由于具有良好的结合亲和力和特异性，已成为多种脑部疾病药物的研究热点。它不仅可以单独用作治疗剂，还可以作为载体与药物共价/非共价结合，从而实现靶向给药。Tau适配体在体外可以部分抑制Tau蛋白的过度磷酸化和聚集，这表明它们可能应用于AD的治疗。然而，血脑屏障和血浆稳定性是阻碍Tau适配体应用的关键问题。
[0005]因此，需要设计一种长单链DNA及其制备方法和应用。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术中的缺陷，提供一种长单链DNA及其应用。
[0007]本专利技术通过下述方案实现：
[0008]一种长单链DNA，所述DNA长单链含有TfR适配体和Tau适配体。
[0009]一种长单链DNA的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0010]第一步、将磷酸化DNA模板与DNA引物混合在NaCl溶液中，所述DNA模板包含TfR适配体和Tau适配体；
[0011]第二步、将第一步所得的混合物进行热循环；
[0012]第三步、退火后，加入T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液得到反应液，所述反应液在16℃下孵育过夜，然后加热到65℃保持10分钟，使T4 DNA连接酶失活，得到环状DNA模板；
[0013]第四步、将第三步所得的环状DNA模板与dNTPs和phi29DNA聚合酶依次加入RCA反应缓冲液中，置于30℃反应2h，即得到含有TfR适配体和Tau适配体的长单链DNA。
[0014]所述第一步的具体步骤为：100μM的磷酸化DNA模板与100μM的DNA引物按体积比为1:1.5的比例混合在100mM NaCl溶液中。
[0015]所述第二步的具体步骤为：在95℃加热2min，65℃加热2min，以1℃/min的速度逐
渐冷却到60℃，循环80次，然后使用PCR热循环器逐渐冷却到12℃。
[0016]所述第三步的具体步骤为：退火后，加入2U/μL的T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液得到反应液，所述反应液16℃孵育过夜，将溶液加热到65℃加热10分钟，使T4 DNA连接酶失活，得到环状DNA模板。
[0017]所述T4 DNA连接酶缓冲液包括50mM Tris
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HCl、10mM MgCl2、10mM DTT和1mM三磷酸腺苷。
[0018]所述第四步的具体步骤为：将第三步所得0.2μM的环状DNA模板与1mM的dNTPs和0.5U/μL的phi29 DNA聚合酶依次加入RCA反应缓冲液中，置于30℃反应2h，得到含有TfR适配体和Tau适配体的长单链DNA。
[0019]一种长单链DNA的应用，所述长单链DNA应用于AD的治疗干预。
[0020]所述长单链DNA应用于穿过血脑屏障，抑制Tau蛋白磷酸化以及聚集，并清除过量ROS。
[0021]所述长单链DNA的TfR适配体通过结合转铁蛋白受体穿过血脑屏障；所述长单链DNA的Tau适配体能够抑制Tau蛋白磷酸化以及聚集；所述长单链DNA材料清除过量ROS。
[0022]本专利技术的有益效果为：
[0023]本申请一种长单链DNA通过引入TfR适配体和Tau适配体，通过滚环扩增的方法合成含多价适配体的长单链DNA。长单链DNA中包含的多个TfR适配体通过结合转铁蛋白受体有效穿过血脑屏障；Tau适配体能够有效抑制Tau蛋白磷酸化以及聚集；长单链DNA材料有效清除过量ROS。所以本申请含有TfR
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Tau多价适配体的长单链DNA能够更精准有效的治疗Tau蛋白病介导的AD。
附图说明
[0024]图1为采用滚环扩增的方法合成含多价适配体的长单链DNA更精准有效的治疗AD的示意图：
[0025]其中A为设计应用于滚环扩增反应的DNA模板，DNA模板包含两个主要元素：i)TfR适配体，ii)Tau适配体。
[0026]B为在AD微环境中，长单链DNA可以消除过度产生的ROS，并治疗Tau蛋白病。
[0027]图2为长单链DNA的形貌表征。
[0028]图3为长单链DNA靶向bEnd.3细胞的示意图。
[0029]图4为长单链DNA清除ROS效果图。
具体实施方式
[0030]下面结合附图对本专利技术优选的实施例进一步说明：
[0031]一种长单链DNA，所述长单链DNA含有TfR适配体和Tau适配体。本申请首次使用含有TfR和Tau适配体的长单链DNA应用于以Tau蛋白病为基础的AD治疗，长单链DNA可以通过结合转铁蛋白受体有效穿过血脑屏障，提高Tau适配体进入AD微环境的能力。如图2所示，原子力显微镜扫描结果显示本申请含有多价适配体的DNA呈长单链状。如图3所示，长单链DNA与bEnd.3细胞(阴性对照HEK293T细胞)孵育1或3小时后的结果示意图，可以看出长单链DNA可以有效靶向bEnd.3细胞。通过检测SH
‑
SY5Y细胞内ROS的DCFH
‑
DA荧光探针的共聚焦图像，
而SH
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SY5Y细胞在双氧水(H2O2)存在下分别用TfR适配体、Tau适配体、线性TfR
‑
Tau适配体或本申请的长单链DNA预处理，从图4中可以看出，本申请的长单链DNA进行预处理后，其清除ROS的效果最佳。
[0032]如图1所示，一种长单链DNA的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0033]第一步、将磷酸化DNA模板与DNA引物混合在NaCl溶液中，所述DNA模板包含TfR适配体和Tau适配体；
[0034]第二步、将第一步所得的混合物进行热循环；
[0035]第三步、退火后，加入T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液得到反应液，所述反应液在16℃下孵育过夜，然后加热到65℃保持10分钟，使T4 DNA连接酶失活，得到环状DNA模板；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长单链DNA，其特征在于，所述DNA长单链含有TfR适配体和Tau适配体。2.一种制备如权利要求1所述长单链DNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：第一步、将磷酸化DNA模板与DNA引物混合在NaCl溶液中，所述DNA模板包含TfR适配体和Tau适配体；第二步、将第一步所得的混合物进行热循环；第三步、退火后，加入T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液得到反应液，所述反应液在16℃下孵育过夜，然后加热到65℃保持10分钟，使T4DNA连接酶失活，得到环状DNA模板；第四步、将第三步所得的环状DNA模板与dNTPs和phi29DNA聚合酶依次加入RCA反应缓冲液中，置于30℃反应2h，即得到含有TfR适配体和Tau适配体的长单链DNA。3.根据权利要求2所述的一种长单链DNA的制备方法，其特征在于，所述第一步的具体步骤为：100μM的磷酸化DNA模板与100μM的DNA引物按体积比为1:1.5的比例混合在100mMNaCl溶液中。4.根据权利要求2所述的一种长单链DNA的制备方法，其特征在于，所述第二步的具体步骤为：在95℃加热2min，65℃加热2min，以1℃/min的速度逐渐冷却到60℃，循环80次，然后使用PCR热循环器逐渐冷却到12℃。5.根据权利要求2所述的一种长单链DNA的制备方法，其特征在于，所述第三步的具体步骤为...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭蔚泓，杨宇，罗磊，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：