一种改变核酸适配体交叉反应性的方法及其在快速检测中的应用技术

本发明专利技术涉及一种改变核酸适配体交叉反应性的方法及其在快速检测中的应用。通过调控磺胺地索辛(SDM)核酸适配体、卡那霉素的大类特异核酸适配体构象自由度，便捷地改变两种核酸适配体交叉反应性。核酸适配体构象自由度调控分别通过变换缓冲液组成、界面固定、两端添加富鸟嘌呤序列三种方式实现。SDM核酸适配体在不同条件下分别对磺胺脒、磺胺喹恶啉、磺胺噻唑具有最高交叉反应；对不同种类磺胺类药物具有高交叉反应。卡那霉素的大类特异核酸适配体在不同条件下分别对卡那霉素A、妥布霉素具有最高交叉反应。分别结合血红素

【技术实现步骤摘要】
一种改变核酸适配体交叉反应性的方法及其在快速检测中的应用


[0001]本专利技术涉及一种改变核酸适配体交叉反应性的方法及其在快速检测中的应用。属于生物技术和分析测试


技术介绍

[0002]有机小分子(相对分子质量<1000道尔顿)是最大的一类环境污染物。对各类有机小分子的高灵敏和高特异性检测，是环境生态保护、食品安全、医疗健康多领域的重要需求。核酸适配体(aptamer)是具有特殊空间结构的单链DNA(ssDNA)或者RNA分子，通常通过被称为指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)的体外筛选方法获得(Nature,1990,346,818
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822；Nature,1992,355,564
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566)，能够与靶标特异性结合。相比于抗体，核酸适配体因其具有易于化学修饰、化学稳定性好、批次之间性能差异较小，而且成本较低的优势。近些年来，其在有机小分子检测领域具有独特优势，备受关注。
[0003]目前还没有基于核酸适配体的商业化的小分子检测产品。阻碍核酸适配体商业化的一个主要原因是小分子靶标的核酸适配体数量依然有限。交叉反应性(cross
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reactivity，CR)是指一个靶标与针对其他靶标开发的配体结合的能力。小分子有许多结构类似物，但在SELEX中只有少数或没有结构类似物被用于负筛选，从而导致核酸适配体的CR不可预测。核酸适配体筛选过程理论上可以通过选择合适的正负筛选的靶标来获得具有不同CR的核酸适配体。但是由于小分子种类的多样性和结构的类似性，和抗体相同，无论获得对单一某种靶标特异的核酸适配体(低CR)，还是获得大类特异性的核酸适配体(高CR)极为困难。目前报道的具有大类特异性的核酸适配体更是寥寥无几。
[0004]抗菌药和抗生素所引起的食品和环境污染严重威胁生态健康，已引起世界范围的广泛关注。小分子抗菌药和抗生素是目前我国以及世界范围内使用量最大，环境和食品污染最严重的一大类。其中磺胺类抗菌药由于价格便宜，使用量极大，是目前我国水体污染最严重的抗菌药。氨基糖苷类抗生素也是我国食品和环境污染物中重点关注的一大类污染物。
[0005]目前有30多种磺胺类药物被广泛应用，其中磺胺地索辛(磺胺间二甲氧嘧啶,sulfadimethoxine,SDM)、磺胺噻唑(sulfathiazole,STZ)、磺胺嘧啶(sulfadiazine,SDZ)和磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine,SMZ)是最常用的兽药。各种磺胺类抗菌药在结构上非常相似，市场上的各种磺胺类酶联免疫检测试剂盒的CR差异巨大。具有中高交叉反应性(CR>50％)的磺胺类药物的数量从3到17种不等，且CR差距大，对磺胺类药物的大类检测无法实现准确定量。这是由于抗体制备需要动物免疫反应，而各种结构类似物的免疫原性对不同动物受体存在显著差异，因此无论获得对单一某种靶标特异的抗体，还是获得大类特异性的高交叉反应抗体都非常困难。氨基糖胺类抗生素常用的有十多种，用于氨基糖类抗生素检测的酶联免疫试剂盒也存在相同的问题。
[0006]在常用30多种磺胺类药物中，目前仅报道了SDM(A coordination polymer nanobelt(CPNB)
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based aptasensor for sulfadimethoxine.Biosens.Bioelectron.2012,33,113
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119)、SMZ和磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline,SQ)三种磺胺类药物的特异性核酸适配体，尚未报道对其它磺胺类药物特异的核酸适配体，以及对磺胺类药物大类特异的核酸适配体。在上述文献中报道中，SDM核酸适配体仅对磺胺地索辛(SDM)具有高亲和力，对磺胺喹恶啉(SQ)和磺胺噻唑(STZ)不具有交叉反应性。在十多种氨基糖苷类抗生素中，目前仅报道了新霉素、链霉素的特异性DNA核酸适配体和对卡那霉素A、卡那霉素B、妥布霉素大类特异的核酸适配体(Gold nanoparticle
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based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer.Anal.Biochem.2011,415,175
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181)。

技术实现思路

[0007]本专利技术涉及一种改变核酸适配体交叉反应性的方法及其在快速检测中的应用。通过调控磺胺地索辛(SDM)核酸适配体(Biosens.Bioelectron.2012,33,113
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119)、卡那霉素大类特异性核酸适配体(Anal.Biochem.2011,415,175
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181)构象自由度，便捷和有效地改变两种核酸适配体的交叉反应性。
[0008]通过DNase I酶降解法，我们首次发现文献报道的磺胺地索辛(SDM)核酸适配体(Biosens.Bioelectron.2012,33,113
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119)在无标记的自由态时，并非对SDM特异，而是具有大类特异性。对所测试的24种磺胺类药物中的20种磺胺类药物均具有中高交叉反应性(CR>＝50％)。SDM核酸适配体构象自由度的调控分别通过变换缓冲液组成、将SDM核酸适配体固定在SiO2光纤界面固定、或者在核酸适配体两端添加富鸟嘌呤序列三种方式实现，均大幅调控了SDM核酸适配体对各种磺胺类药物的CR。其中通过在富鸟嘌呤序列和SDM核酸适配体之间添加连接链，可以进一步调控对部分磺胺类药物CR。SDM核酸适配体在不同条件下分别对磺胺脒(SGD)、磺胺喹恶啉(SQ)、磺胺噻唑(STZ)具有最高交叉反应性。SDM核酸适配体在不同条件下分别对8
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21种不同种类的磺胺类药物具有高交叉反应。分别结合血红素
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ABTS
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H2O2比色反应和倏逝波传感器，实现了对磺胺噻唑(STZ)、磺胺脒(SGD)、磺胺甲二唑(SMI)、磺胺甲恶唑(SMZ)的定量检测和磺胺类药物的大类特异性比色和荧光检测。
[0009]文献报道的卡那霉素大类特异核酸适配体(Anal.Biochem.2011,415,175
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181)对卡那霉素A、卡那霉素B、妥布霉素(TOB)的CR依次减小。在该核酸适配体的两端添加富鸟嘌呤序列后，对妥布霉素(TOB)、卡那霉素B、卡那霉素A的CR依次减小。分别结合血红素
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ABTS
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H2O2比色反应和倏逝波传感器，实现了对妥布霉素(TOB)、卡那霉素B、卡那霉素A的比色和荧光定量检测。
[0010]本专利技术的技术方案为一种改变核酸适配体交叉反应性的方法，该方法是通过调控核酸适配体的构象自由度，改变核酸适配体的交叉反应性(CR)。
[0011]进一步，上述改变核酸适配体交本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改变核酸适配体交叉反应性的方法，其特征在于，该方法是通过调控核酸适配体的构象自由度，改变核酸适配体的交叉反应性(CR)。2.如权利要求1所述的改变核酸适配体交叉反应性的方法，其特征在于，该方法是通过调控磺胺地索辛(SDM)核酸适配体、卡那霉素大类特异性核酸适配体构象自由度，改变两种核酸适配体的交叉反应性(CR)。3.如权利要求1或2所述的改变核酸适配体交叉反应性的方法，其特征在于，核酸适配体构象自由度的调控分别通过变换缓冲液组成、将核酸适配体固定在SiO2光纤界面固定、或者在核酸适配体两端添加富鸟嘌呤序列三种方式实现，调控核酸适配体对各种结构类似物的CR。4.如权利要求3所述的改变核酸适配体交叉反应性的方法，其特征在于，通过在富鸟嘌呤序列和SDM核酸适配体之间添加连接链，进一步调控对磺胺类药物CR，或者在卡那霉素A的核酸适配体末端添加2:2裂分的G4结构得到G4
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KANA。5.如权利要求3所述的改变核酸适配体交叉反应性的方法，其特征在于，变换缓冲液组成为分别测试核酸适配体在1
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DNase缓冲液：10mM三羟甲基氨基甲烷
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盐酸Tris
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Hcl，2.5mM氯化镁，0.1mM氯化钙，pH 7.5和1
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筛选缓冲液：20mM Tris
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HCl,50mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH 8.0中对24种磺胺类药物的交叉反应性。6.如权利要求3所述的改变核酸适配体交叉反应性的方法，其特征在于，将核酸适配体固定在SiO2光纤界面固定为通过光纤表面的羟基化、硅烷化、偶联、还原和封闭步骤将氨基修饰的核酸适配体NH2‑
SDM偶联在光纤表面。7.如权利要求3所述的改变核酸适配体交叉反应性...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄新徽，成肖，危振哲，王朔，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：