【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物化学领域，特别是涉及一种rna加帽率的定量测定方法。
技术介绍
1、相比基因治疗而言，以体外转录(ivt)rna作为治疗药物，没有基因组插入风险，不会改变dna而产生不可预料的影响。因此，rna药物的副作用更小，已然成为最为热门的药物研究方向之一，具有广泛的应用前景。
2、在rna的药物研究过程中，rna的制备是至关重要的一环。rna的制备流程主要包括：dna转录模板线性化；体外转录获得未加帽rna；rna 5'端加帽修饰得到5'端加帽修饰rna。其中，5'端加帽修饰对于mrna在体内的翻译效率和稳定性有至关重要的作用。
3、现有的5'端加帽主要有两种方案，即：与转录同时发生的“共转录加帽”和转录完成后酶修饰加帽。无论哪种加帽方案，其加帽效率都很难达到100％，而未加帽rna在体内不稳定容易降解。因此，基于mrna治疗的临床前和临床研究中，对mrna加帽效率的检测评估是mrna质量控制的重要环节。
4、现有的加帽效率评估方法主要有以下几种：
5、1)基于放射性同位素标记的方法(b.r.anderson et al.,2010；grudzien etal.,2004；stepinski,waddell,stolarski,darzynkiewicz,&rhoads,2001)。该方法存在如下问题：其放射性同位素的使用，会对人体造成一定的伤害。
6、2)中国专利申请cn105209633a公布的方法，基于elsa原理，使用抗m7g的特异
7、3)中国专利申请cn105051213a公布的方法，利用dna寡聚体探针特异性地与目的rna结合形成dna-rna杂交分子，随后利用一种或多种核酸酶(核酸酶s1、rna酶h或者其他的5’核酸外切酶)对目的rna进行降解，得到目的rna5’端区域(不超过5个碱基)，最后通过色谱的方法分析5’端区域加帽和未加帽的的占比。该方法存在如下问题：a，对探针特异性要求较高；b，rna酶h对dna-rna杂交分子的酶切位点特异性不高，最终的产物成分会比较复杂而对定量分析产生干扰导致定量结果可靠性降低；c，需要色谱和质谱等贵重仪器，在工业生产中存在局限性。
8、4)中国专利申请cn115896239a公布的方法，对rna样本进行修饰，设计长度≤30nt的逆转录引物，对修饰的rna样本进行逆转录，获得长度≤50nt的产物，通过凝胶电泳对包含修饰rna的rna样品的rna修饰效率进行定量。该方法存在如下问题：a.操作过程复杂；b.间接测定加帽效率，受逆转录效率的影响较大。
9、5)中国专利申请cn116735729a公布的方法，设计一段长度为20nt-40nt的mrna序列并且经过特定的序列优化，尽量减少了其被环境中rnase的降解。采用高效液相色谱法或lc-ms方法对所述反应物进行检测并计算获得所述mrna的5'末端加帽率，得到所述待测加帽酶的活性。该方法存在如下问题：a.需要色谱和质谱等贵重仪器；b.mrna序列必须由a碱基或g碱基构成，存在局限性。
10、因此，亟须一种新的rna加帽率的定量测定方法，以解决上述现有技术中存在的不足，使加帽效率的评估方法同时满足高效、经济、易操作等优点。
技术实现思路
1、为解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种rna加帽率的定量测定方法，以使rna加帽率的评估方法同时具有高效、经济、易操作等优点。
2、本专利技术解决技术问题的技术方案具体如下：
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种rna加帽率的定量测定方法，所述方法包括如下步骤：
4、1)体外转录制备短链rna，rna长度≤20nt；
5、2)将步骤1)制备的短链rna用作化学修饰的底物，进行rna加帽修饰；
6、3)通过电泳对步骤1)制备的rna样本进行高分辨率的分离和鉴定；通过对比加帽前后的rna样本电泳图谱，实现对rna加帽率的定量评估。
7、优选地，所述步骤1)中，转录的操作包括：利用t7rna聚合酶制备出短链rna(≤20nt)；
8、优选地，所述步骤2)中，rna加帽的操作是直接对转录产物进行加帽修饰。
9、优选地，所述步骤3)中，对rna加帽率的定量评估具体过程如下：先对rna加帽样本进行跑胶，然后根据加帽rna的条带区域和未加帽rna的条带区域，计算rna加帽率。更优选地，所述跑胶中所用的胶为尿素聚丙烯酰胺胶；所述跑胶中所用胶的浓度的确定方法为：根据所述加帽rna样本的长度，对所用胶的浓度进行确定。
10、优选地，所述步骤3)中，通过紫外照胶仪和imagej软件，分析加帽rna的条带区域和未加帽rna的条带区域。更优选地，所述步骤3)中，根据加帽rna的条带区域和未加帽rna的条带区域，计算rna加帽率的具体操作包括如下步骤：
11、1)将紫外照胶仪拍照后的原图用imagej软件进行分析，确定加帽rna的条带区域和未加帽rna的条带区域；
12、2)用同一大小的矩形框框选中同一泳道中加帽产物(n+1)条带区域,未加帽产物(n)条带区域，以及空白区域，计算加帽rna的条带区域的灰度值a，计算未加帽rna的条带区域的灰度值b，计算所述加帽rna的条带区域与所述未加帽rna的条带区域之间的空白区域的灰度值c；根据a、b和c，计算rna加帽率，计算公式如下：
13、
14、优选地，所述步骤1)-3)中，所述rna样品为未纯化或纯化的样品。
15、在本专利技术的第二方面，还提供了如第一方面所述rna加帽率的定量方法在加帽酶加帽效率检测、短链rna制备的质量控制及短链rna作为治疗药物的质量控制中的应用。
16、本专利技术具有如下技术效果：
17、1)本专利技术的方法具有快速、便捷的特点，可以在半天之内完成加帽效率的检测，操作过程中无需对rna样品进行纯化、也无需使用放射性同位素等危险试剂以及色谱、质谱等大型精密仪器。因此，本专利技术提供的rna加帽率定量检测方法在科学研究领域具有广泛的应用前景。
18、2)现有技术的检测rna加帽率的方法，需对rna样品进行纯化，本专利技术的方法可以无需对rna样品进行纯化，也能够准确rna定量检测加帽率。
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1.一种RNA加帽率的定量测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，转录的操作包括：利用T7RNA聚合酶制备出长度≤20nt的短链RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，RNA加帽的操作是直接对转录产物进行加帽。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，对RNA加帽率的定量评估具体过程如下：先对RNA加帽样本进行跑胶，然后根据加帽RNA的条带区域和未加帽RNA的条带区域，计算RNA加帽率。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述跑胶为凝胶电泳，所述凝胶电泳中所用的胶为尿素聚丙烯酰胺胶。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述跑胶中所用胶浓度的确定方法包括：根据所述加帽RNA样本的长度，对所用胶的浓度进行确定。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，通过紫外照胶仪和ImageJ软件，分析所述条带区域。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中
9.根据权利要求1任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)-3)中，所述RNA样品为未纯化或纯化的样品。
10.如权利要求1-9任意一项所述RNA加帽率的定量测定方法在加帽酶加帽效率检测、短链RNA制备的质量控制及短链RNA作为治疗药物的质量控制中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种rna加帽率的定量测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，转录的操作包括：利用t7rna聚合酶制备出长度≤20nt的短链rna。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，rna加帽的操作是直接对转录产物进行加帽。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，对rna加帽率的定量评估具体过程如下：先对rna加帽样本进行跑胶，然后根据加帽rna的条带区域和未加帽rna的条带区域，计算rna加帽率。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述跑胶为凝胶电泳，所述凝胶电泳中所用的胶为尿素聚丙烯酰胺胶。
6.根据权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐茂森，程贤翊，王举，戴康，马运龙，王春香，
申请(专利权)人：江苏康为世纪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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