【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于car-t疗法，尤其涉及嵌合抗原受体t细胞标记及其在体示踪中的用途。
技术介绍
1、作为一种新兴的免疫治疗方式，嵌合受体t细胞(car-t)疗法通过基因工程技术使t细胞表达靶向特异性肿瘤抗原的嵌合受体，从而杀伤特定肿瘤细胞。
2、car-t作为一种“活药”，其吸收、分布、代谢、排泄不符合传统药物的药代动力学。为进一步提高其疗效，需对car-t细胞的体内迁移、存活情况、生物分布、是否在靶及其数量、作用持久性以及不良反应等进一步研究。为全面了解其体内行为与治疗效果，实时监测与动态追踪成像显得至关重要。通过监测car-t细胞的浸润动力学和生物分布，我们能评估其对肿瘤的攻击效率和细胞克隆扩增情况，有助于治疗效果的准确评估。同时，动态追踪有助于优化治疗方案，确定最佳剂量、时间和给药途径，最大化治疗效果并减少潜在毒性。此外，追踪car-t细胞可深入研究治疗机制和耐药机制，提高疗法的效果。通过实时监测car-t细胞的体内分布与活性，我们能够实现个体化治疗，根据每患者的car-t细胞动态特征调整治疗方案，提高疗效同时减少不良反应。最重要的是，监测car-t细胞的体内活动可及早发现和预测潜在的不良事件，为采取预防措施提供关键信息，提高治疗的安全性。综上所述，car-t细胞在体内监测与动态追踪成像的必要性不仅深化了对治疗机制的理解与提高治疗效果，同时为个体化治疗与预防不良事件提供了关键支持，推动了car-t细胞疗法的不断发展。
3、如何对car-t细胞有效标记并作在体动态显像是car-t可视化技术的关键。通过实
4、间接标记涉及经基因工程技术改造的car-t细胞，其能在体内招募探针或相互作用，最终产生可检测的信号，又称为报告基因显像。间接标记依赖于报告基因的共表达，这一报告基因在构建car时通过慢病毒载体等技术被引入t细胞，并嵌入一段具有辅助t细胞成像功能的基因序列。报告基因的表达导致细胞产生有助于成像的功能蛋白，后者能够介导car-t细胞与成像探针的募集或结合。单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(herpes simplexvirus type 1thymidine kinase,hsv1-tk)是目前应用最为广泛的酶报告基因之一。最初被引入细胞内作为一种自杀基因，随后加入更昔洛韦等无环鸟苷后，hsv1-tk能够磷酸化这些药物，从而阻断dna的合成，诱导细胞死亡。yaghoubi等研究团队成功导入hsv1-tk到细胞毒性t细胞，用于治疗一名57岁多形性胶质母细胞瘤患者，并通过18f-fhbg进行car-t细胞在体内的监测。通过正电子发射型计算机断层显像(positron emission computedtomography,pet)，研究发现在胶质瘤切除部位有显著的18f-fhbg积累，并且在远端胼胝体肿瘤也观测到了car-t细胞信号。keu等研究团队进行了一项利用hsv1-tk追踪car-t细胞的临床试验，通过构建共表达hsv1-tk和靶向il-13zatakine car的car-t细胞，并采用18f-fhbg作为探针，成功进行了pet纵向追踪。间接标记显像方法在car-t细胞研究中虽然提供了对细胞动态的稳定监测，但也存在一些不足之处。首先，该方法需要依赖报告基因的共表达，这意味着在构建car-t细胞时必须通过慢病毒载体等技术转导t细胞，并插入用于辅助成像的基因。这一过程可能引入额外的复杂性和操作风险，限制了该方法的广泛应用。其次，报告基因的引入可能对car-t细胞的生物学特性产生干扰，可能影响细胞的功能和治疗效果。这种影响可能源于基因的插入位置、表达水平等因素，需要谨慎考虑，以确保引入的基因不会对car-t细胞的整体性能产生负面影响。另外，报告基因的稳定性也是一个潜在问题。虽然在car-t细胞的整个生命周期中具备反复成像的能力，但在长时间内可能面临基因沉默或表达波动的挑战，影响显像的可靠性和准确性。
5、而直接标记则无需对car-t进行基因改造，成像探针可以直接进入胞内或结合于细胞表面。因此直接标记可能是一种更为可行，技术门槛相对较低的技术手段，常用探针与细胞共孵育和电穿孔等在体外以探针标记细胞，对回输到体内的car-t细胞实施动态追踪。然而，一方面随着细胞的分裂增殖，共孵育很容易造成标记探针的稀释和丢失；另一方面，在电穿孔过程中，细胞受到电场的强烈作用，可能导致细胞膜的破裂和损伤，这可能会影响细胞的活力和功能。因此，在当前研究环境下，开发一种无创有效的显像探针，对回输到体内后的car-t细胞实施动态成像与追踪，实时监测car-t在体内的浸润动力学和生物分布具有重要意义。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供嵌合抗原受体t细胞标记及其在体示踪中的用途，主要为了解决目前无法有效的实现对car-t细胞原位标记并实时成像和监测的问题。
2、为了解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术第一方面涉及原位示踪嵌合抗原受体t细胞的制备方法及该方法制备所得的嵌合抗原受体t细胞。
4、原位示踪嵌合抗原受体t细胞的制备方法，包括下述步骤
5、s1、制备car-t细胞，并将ac4mannaz与car-t细胞共孵育，
6、s2、加入荧光染料cfse、dir、cytotell red 650、did、dis中至少之一共孵育以标记car-t细胞，染色后去除未结合荧光染料，获得原位示踪嵌合抗原受体t细胞。
7、原位示踪嵌合抗原受体t细胞是在进行car-t治疗时，能够对car-t细胞进行实时监测，实现代谢性标记的实时追踪。尤其是在血液肿瘤的治疗中，可以更好的观测car-t细胞弥漫分布情况。
8、制备car-t细胞所采用的方法可选用现有的方法，根据不同的需要制备不同的car-t细胞，比如较为常规的为人t细胞的分离培养：收集健康志愿者的外周血，分离pbmc，使用磁珠分选出cd4+t细胞及cd8+t细胞，分别加入预包被抗cd3、cd28抗体的细胞培养瓶，并使用il-2(50ng/ml)进行刺激，让其更快生长和分裂。
9、就该制备方法中一些工艺条件至少可选下述至少之一：
10、其一，ac4mannaz浓度为50±5μm，s1、s2中均在37±1℃环境中共孵育，s1中共孵育24～48h，s2中共孵育10～30min。
11、其二，car-t细胞所用t细胞为人原代t细胞。
12、本专利技术第二方面涉及本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.原位示踪嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤
2.根据权利要求1所述的原位示踪嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，Ac4ManNAZ浓度为50±5μM，S1、S2中均在37±1℃环境中共孵育，S1中共孵育24～48h，S2中共孵育10～30min。
3.根据权利要求1所述的原位示踪嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，CAR-T细胞所用T细胞为人原代T细胞。
4.权利要求1-3任一所述原位示踪嵌合抗原受体T细胞的制备方法制备所得原位示踪嵌合抗原受体T细胞。
5.权利要求1-3任一所述原位示踪嵌合抗原受体T细胞在制备治疗肿瘤疾病的产品中的应用；其中，所述治疗肿瘤疾病的产品中的原位示踪嵌合抗原受体T细胞能被实时动态追踪。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述肿瘤为血液肿瘤。
7.CAR-T细胞实施动态追踪系统，其特征在于，包括
8.根据权利要7所述的CAR-T细胞实施动态追踪系统，其特征在于，所述检测仪器至少为流式、PCR检测仪、PET检测仪中任一。
9
10.根据权利要求9所述的可对CAR-T细胞进行原位示踪的动物模型的制备方法，其特征在于，T细胞置于Ac4ManNAZ中预培养温度为37℃，加入CFSE和/或DIR后共孵育温度为37℃；所述动物模型为小鼠模型。
...【技术特征摘要】
1.原位示踪嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，包括下述步骤
2.根据权利要求1所述的原位示踪嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，ac4mannaz浓度为50±5μm，s1、s2中均在37±1℃环境中共孵育，s1中共孵育24～48h，s2中共孵育10～30min。
3.根据权利要求1所述的原位示踪嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，car-t细胞所用t细胞为人原代t细胞。
4.权利要求1-3任一所述原位示踪嵌合抗原受体t细胞的制备方法制备所得原位示踪嵌合抗原受体t细胞。
5.权利要求1-3任一所述原位示踪嵌合抗原受体t细胞在制备治疗肿瘤疾病的产品中的应用；其中，所述治疗肿瘤疾...
【专利技术属性】
技术研发人员：梅恒，陈钊钊，胡豫，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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