【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和分子生态学领域，具体涉及检测达氏鲟edna的引物、探针及方法。
技术介绍
1、达氏鲟是长江上游特有鱼类，是长江生态健康的重要指示生物。20世纪中下叶以来，由于人工捕捞、兴修水利、环境污染等原因，达氏鲟野生种群数量急速下降，在1998年被定为国家一级保护动物。已有的监测数据表明，达氏鲟的自然繁殖在2000年左右已经停止。在此严峻形势下，随着达氏鲟的全人工繁殖技术不断发展，达氏鲟的人工繁殖群体不断增加，近20年来，其子一代、子二代、子三代先后成功繁育。实时监测鱼类群体的动态，如洄游、分布等，对渔业资源评估、鱼类资源保护、维护水域生态平衡具有重要意义。过去，监测达氏鲟动态的方法主要是人工捕捞或者增殖放流标记法，但这些技术手段成本过高、过程繁琐，且会对达氏鲟群体造成一定损伤，无法实现无创监测达氏鲟群体。
2、环境dna是指从环境样本中直接获取的dna，包括动植物、微生物在空气、土壤、水体等环境中释放的dna。环境dna技术是指从环境样品中直接提取目的基因片段后利用各种分子技术进行定性或定量分析的方法。利用环境dna技术可以有效检测到水体中的稀有物种和隐秘物种，提高调查结果的准确性，因此，dan yu等将edna技术与数字pcr技术相结合，利用8个月的时间，沿着中华鲟产卵场沿线的4个地点采样，调查了中华鲟群体在长江下游的空间分布。相较于传统检测方法，edna技术与pcr技术相结合，可以实现无创监测达氏鲟，但这种方法耗时过长，需要精密设备，无法实现在野外实时监测达氏鲟群体。因此，建立一种新型、快速、灵敏
3、已有的监测达氏鲟的方案是通过环境dna技术与pcr技术结合，沿着达氏鲟产卵场沿线的地点采集水样，后回到实验室抽滤水样提取再进行pcr扩增，调查达氏鲟群体在长江上游的空间分布。
4、相较于传统检测方法，现有的edna技术与pcr技术相结合，可以实现无创监测达氏鲟，但这种方法耗时过长，需要精密设备，对实验环境要求较高，无法实现在野外实时监测达氏鲟群体。
5、因此，需要开发一种新的检测方法和相关引物探针，实现达氏鲟edna快速、准确和即时检测。
技术实现思路
1、本专利技术设计了达氏鲟的rpa特异性探针和引物，将优化后的edna提取和扩增技术与rpa-lfd结合，建立了一种达氏鲟的rpa-lfd检测方法。该方法操作简便、灵敏性高、特异性强、短时间内实现结果可视，且不需要精密仪器，在38℃、50min内即可得到检测结果，适合野外实时监测研究。
2、一种用于鉴定达氏鲟或中华鲟edna的引物和探针，选自：
3、(1)上游引物(正向引物)的序列如seq id no.1所示，下游引物(反向引物)的序列如seq id no.2所示，探针的序列如seq id no.3所示；或者，
4、(2)上游引物的序列如seq id no.4所示，下游引物的序列如seq id no.5所示，探针的序列如seq id no.6所示。
5、第一对引物、探针序列：
6、seq id no.1正向引物ctgacttccagaagtactacaaggcctcgac
7、seq id no.2反向引物gtatggttattagggacgggtttattattgg
8、seq id no.3探针catcctctcaacctgacagaaactagccccgtttgccctaatttat；
9、其中，seq id no.3探针的3’端用c3spacer修饰，第31位核苷酸g用thf修饰；
10、第二对引物、探针序列：
11、seq id no.4正向引物aacatatcaagaacacaagattaatgagat
12、seq id no.5反向引物gtcatggattctacagtatttttaacatca
13、seq id no.6探针aaactgaactattactggcatctggcttctatctcaggtccattaaca
14、其中，seq id no.6探针的3’端用c3spacer修饰，第33位核苷酸c用thf修饰；
15、所述的引物和探针分别用不同的标记物进行标记；所述的标记物为荧光素和生物素。进一步，反向引物的生物素(biotin)标记，探针的5’端用5’端用荧光素(fam)标记。
16、一种用于鉴定达氏鲟edna的试剂盒，包括上所述的引物和探针组合中的至少一个。
17、一种检测达氏鲟edna的方法，步骤包括：
18、(1)从水样中提取edna，加入上述引物和探针，rpa扩增；
19、(2)将rpa扩增产物滴加到带有抗fam和biotin标记的lfd试纸条上进行检测。
20、步骤(1)中，rpa扩增的条件为，将edna样本溶液与引物、探针和rpa反应体系混合，37-39℃孵育。
21、步骤(2)中，rpa扩增产物稀释10-30倍后滴加到lfd试纸条上。
22、提取edna的方法为：
23、水样用滤膜过滤，抽滤后将滤膜剪碎，加入chelex-100溶液和蛋白酶k，50-60℃孵育5-15分钟；10-20分钟升温至95-100℃；离心取上清液。
24、本专利技术的一个优选方案中，水样用滤膜过滤，抽滤后将滤膜剪碎，加入10％chelex-100溶液和蛋白酶k，560℃孵育10分钟；15分钟升温至99℃；离心取上清液。
25、上述引物探针组合、试剂盒及方法，能够实现快速、便捷地检测达氏鲟edna，并且灵敏高，特异强，从而实现野外实时监测达氏鲟。
26、采用本专利技术的两组引物探针均能检测到达氏鲟和中华鲟，鉴于中华鲟生活在长江下游，达氏鲟生活在长江上游，二者不会存在时空交叉，故不会产生检测到假阳性结果，可以分别用于检测达氏鲟和中华鲟。
27、本专利技术通过设计特异性的达氏鲟的rpa引物和探针组合，采用重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(rpa-lfd)检测技术，并优化edna提取过程，将edna技术与rpa技术结合，真正实现了无创野外实时监测达氏鲟群体动向。不需要精密仪器，对温度条件要求不高，在野外即可实时进行检测试验，为该物种的活动情况和生境选择等积累资料，对于了解达氏鲟种群动态分布具有重要意义，为长江濒危鱼类保护和恢复评估提供科学方法。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于检测达氏鲟eDNA的引物和探针，其特征在于，正向引物的序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物的序列如SEQ ID No.2所示，探针的序列如SEQ ID No.3所示；或者，正向引物的序列如SEQ ID No.4所示，反向引物的序列如SEQ ID No.5所示，探针的序列如SEQID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定达氏鲟eDNA的引物和探针，其特征在于，所述的正向引物或反向引物以及探针分别用生物素和羧基荧光素标记。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定达氏鲟eDNA的引物和探针，其特征在于，所述的反向引物用生物素标记，所述的探针用羧基荧光素标记。
4.根据权利要求1所述的用于鉴定达氏鲟eDNA的引物和探针，其特征在于，所述的SEQID No.3探针的3’端用C3spacer修饰，第31位核苷酸G用THF修饰；
5.一种用于鉴定达氏鲟eDNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的引物和探针。
6.一种检测达氏鲟eDNA的方法，其特征在于，步骤包括：
7.根据权利要求6所
8.权利要求1-4任一项所述的引物和探针在检测达氏鲟eDNA方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测达氏鲟edna的引物和探针，其特征在于，正向引物的序列如seq idno.1所示，反向引物的序列如seq id no.2所示，探针的序列如seq id no.3所示；或者，正向引物的序列如seq id no.4所示，反向引物的序列如seq id no.5所示，探针的序列如seqid no.6所示。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定达氏鲟edna的引物和探针，其特征在于，所述的正向引物或反向引物以及探针分别用生物素和羧基荧光素标记。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定达氏鲟edna的引物和探针，其特征在于，所述的反向引物用...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晨虹，凌岚馨，王慧芳，梁琳琰，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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