本发明专利技术公开了一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用。本发明专利技术筛选出结核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)双特异的TCR，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8+T细胞中，获得表达结核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)双特异TCR的CD8+T细胞。CD8+T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别结核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)并介导IFN-γ、TNF-α、GrB细胞因子分泌和细胞毒活性，这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体具有结核/HIV共感染疾病基因治疗的应用价值，可为结核/HIV共感染的过继细胞免疫治疗开辟新径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种结核/HIV抗原肽双特异性T细胞受体(TCR)，以及利用该TCR制备得到的一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体，逆转录病毒载体转染得到的CD8+ T细胞及其在制备抗结核/HIV共感染疾病药物中的应用。
技术介绍
结核(Tuberculosis, TB)是全球最致命的慢性感染疾病之一。近十年来，由于全球流动人口增加，结核病防治工作受到忽视，多药耐药结核菌广泛流行，免疫抑制剂大量使用，尤其是HIV与结核分枝杆菌并发感染，致使结核病重新蔓延，全球疫情再度恶化。结核潜伏感染者一旦感染HIV，机体免疫系统会被加速破坏，减弱甚至丧失对结核分枝杆菌的抑制效应，患者更容易发展成活动性结核；同时，结核分枝杆菌通过刺激单核细胞和巨噬细胞 大量分泌单核细胞趋化蛋白-I (MCP-I)促进HIV的转录，加速病毒增殖，促使病情恶化。2010年全球新增结核病人880万，其中110万共感染HIV ;全球结核死亡人数140万，其中1/4为合并感染HIV致死。目前，TB/HIV双重感染者的治疗主要是抗TB与抗逆转录病毒治疗的结合，其疗程长，多种药物相互作用，药物重叠的毒副作用大，易产生耐药性，病人服药依从性差，对这两种疾病同时有效的药物稀缺，整合抗TB与抗逆转录病毒治疗存在时间和药物选择的巨大挑战，以及出现免疫重建炎症综合症等问题。因此，亟需开发针对TB/HIV共感染行之有效的治疗方法。抗TB与抗HIV感染的免疫机制都是以T细胞介导的细胞免疫为主。已有大量实验证据表明，抗原特异性⑶8+ T细胞在控制TB和HIV感染中发挥着至关重要的作用。效应CD8+ T细胞通过以下三种途径来发挥作用1)发挥细胞毒作用，通过穿孔素和颗粒酶B (granzyme B)途径直接杀伤感染靶细胞；2)释放Thl型细胞因子，如干扰素-Y(interferon- Y , IFN-Y )、肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor- α , TNF-α),抑制病原体复制，促进巨噬细胞清除胞内病原体；3)介导Fas/FasL杀伤机制，直接杀伤靶细胞。而在TB/HIV共感染者体内，效应⑶8+ CTL数量和反应水平均很低。因此，通过过继转移大量效应⑶8+ T细胞至TB/HIV共感染者体内，可增强其抗TB/HIV感染的能力。过继细胞免疫治疗已在抗TB和HIV感染中显示了巨大潜力。利用灭活的结核菌体外致敏PBL，将其回输给多药耐药肺结核患者，取得良好疗效。将患者自体HIV特异性CD8+CTL过继回输治疗6例HIV感染者，最初2周所有患者⑶4计数增加，5名患者血浆病毒血症减少。24周后，2名患者的HIV病毒负载继续减少，另I名患者⑶4计数增加超过2倍。尽管过继细胞免疫治疗展现出光明的前景，但这种方法的普遍应用却存在许多障碍。我们很难从处于疾病进展期的患者体内分离出效应T细胞，因为此时CTL反应是不断消耗的，接受长期治疗的个体也是如此，因为随着病原体负载减少，针对病原体的CTL反应也减少。另夕卜，从患者体内分离出的T细胞往往是已最终分化的，很难扩增。即使可以扩增，回输患者体内后其存活时间也很短。而通过抗原特异T细胞受体基因修饰初始T细胞，人为赋予普通T细胞识别特异抗原的能力，短期内获得大量效应T细胞，则可有效解决这一问题。T细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)是所有T细胞表面的特征性标志，在T细胞抗原识别中起关键作用。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Va、νβ)又各有三个高变区⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中以⑶R3变异最大，直接决定了 TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，⑶R1XDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。根据TCR να、νβ基因的同源性，可将80多个TCR Va基因分为32个家族、60多个TCR νβ基因分为24个家族。利用每个T细胞克隆均有其独特CDR3序列的特点，采用CDR3谱型分析技术，可测定各TCR家族各CDR3出现的频率，由此反映T细胞的克隆性。未接受抗原刺激的T细胞中，针对各种抗原的T细胞克隆分布均匀，表现为多家族和多克隆性，具体地，表现为各家族均出现呈高斯分布的约8个CDR3峰；抗原刺激则引起识别该抗原 的某一个或几个特异TCR家族T细胞反应性增生，表现为该家族CDR3成员出现少于4个峰的寡克隆或单克隆分布，其中具有单克隆CDR3分布(表现为单峰)的TCR家族即是抗原特异单克隆增生的TCR家族。对该家族PCR产物进行测序，可获得抗原特异TCR CDR3序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于筛选出结核肽Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)和HIV肽Eiw12ch128(KLTPLCVTL)双特异的TCR，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8+ T细胞中，获得表达结核肽 Ag85B199_207 (KLVANNTRL)和 HIV 肽 Env120^128 (KLTPLCVTL)双特异 TCR 的 CD8+ T 细胞，以及该经过TCR基因修饰的CD8+ T细胞在制备抗结核/HIV共感染疾病药物中的应用。本专利技术所采用的技术方案是一种结核/HIV抗原肽双特异性T细胞受体(TCR)，包括α链和β链，其中，α链的⑶R3区含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β链的⑶R3区含有SEQ ID NO: 4所示的序列。所述TCR的α链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。优选的，所述TCR的α链氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示，β链氨基酸序列如SEQ ID NO: 8 所示。编码上述结核/HIV抗原肽双特异性TCR的基因。一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO: 13所示。一种重组逆转录病毒载体，含有编码结核/HIV抗原肽双特异性TCR的基因。所述逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上述重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。上述逆转录病毒转染的⑶8+T细胞。结核/HIV抗原肽双特异性TCR、编码该TCR的基因，含有该基因的重组逆转录病毒载体、逆转录病毒、该逆转录病毒转染的CD8+T细胞在制备抗结核病、艾滋、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。具体步骤流程如下 I、筛选出结核肽 Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)和 HIV 肽 Env12(l_128 (KLTPLCVTL)双特异的TCR ①淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheralbloo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结核/HIV抗原肽双特异性T细胞受体（TCR），包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ？ID？NO:？3所述的序列；β链的CDR3区含有SEQ？ID？NO:？4所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马骊，周超颖，温茜，罗微，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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