本发明专利技术公开了一种结核肽Ag85B199–207特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用。本发明专利技术成功筛选出结核肽Ag85B199–207（KLVANNTRL）特异的TCR，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8+T细胞中，获得表达结核肽Ag85B199–207特异TCR的CD8+T细胞。该经过TCR基因修饰的CD8+T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别结核肽Ag85B199–207并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有结核病基因治疗的应用价值，可为结核病的过继细胞免疫治疗开辟新径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种结核抗原肽特异性T细胞受体(TCR)，以及利用该TCR制备得到的一种用于结核基因治疗的逆转录病毒载体，逆转录病毒载体转染得到的CD8+T细胞及其在制备抗结核病药物中的应用。
技术介绍
结核是全球范围内感染率最高的传染病，病死率仅次于艾滋病。近年来，随着人口流动的增加、HIV与结核菌伴发感染、以及耐药和多重耐药菌株的流行，使全球结核病死灰复燃，呈现卷土重来之势。据WHO统计报告，全世界有1/3人口受到结核菌感染，结核病患者达2000万，每年新发病人数800-1000万、因结核病死亡人数300万。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核病人数高居全球第二，目前结核菌感染人数已超过6亿，结 核病患者达600万之多，每年新发病人数150万、因结核病死亡人数25万，全国肺结核报告发病人数和死亡人数一直高居各种传染病之首。目前结核病治疗仍以化疗为主，但存在疗程长、毒副作用大等缺点，降低了病人服药顺从性，病人不规则服药、自行停药、选择性服药等都可能提高结核杆菌耐药的机率，耐药菌的产生是导致结核难治的根本原因，单一调整化疗方案效果有限；而且化疗无法解决因机体免疫力低下或缺陷引起的内源性复燃和外源性再感染。因此，开创新的有效的治疗方法已成为当务之急！ T细胞抗原受体(T cell receptor, TCR)是所有T细胞表面的特征性标志，在T细胞抗原识别中起关键作用。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Va、νβ )又各有三个高变区⑶R1XDR2、⑶R3，其中以⑶R3变异最大，直接决定了 TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，⑶R1、⑶R2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。根据TCR να、νβ基因的同源性，可将80多个TCR Va基因分为32个家族、60多个TCR νβ基因分为24个家族。利用每个T细胞克隆均有其独特CDR3序列的特点，采用CDR3谱型分析技术，可测定各TCR家族各CDR3出现的频率，由此反映T细胞的克隆性。未接受抗原刺激的T细胞中，针对各种抗原的T细胞克隆分布均匀，表现为多家族和多克隆性，具体地，表现为各家族均出现呈高斯分布的约8个CDR3峰；抗原刺激则引起识别该抗原的某一个或几个特异TCR家族T细胞反应性增生，表现为该家族CDR3成员出现少于4个峰的寡克隆或单克隆分布，其中具有单克隆CDR3分布(表现为单峰)的TCR家族即是抗原特异单克隆增生的TCR家族。对该家族PCR产物进行测序，可获得抗原特异TCR CDR3序列。⑶8+ T细胞是T淋巴细胞的一种，通过抗原识别受体(TCR α β )识别多肽抗原与自体MHC I类分子形成的复合物，能特异性杀伤表达其TCR所识别的抗原表位的靶细胞，在抗细菌与病毒感染、急性同异型移植物排斥和对肿瘤细胞的杀伤作用中是重要的效应细胞，被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。近年来，在感染结核杆菌的小鼠模型中发现，功能性CD8+ T细胞的缺乏显著增加小鼠对结核杆菌的易感性，表明CD8+ T细胞与CD4+T细胞一样，在抗结核感染中具有重要的保护作用。临床研究也发现，⑶8+ T细胞能识别结核杆菌感染的细胞，通过释放IFN- Y、溶解感染的靶细胞和直接杀伤细胞内细菌，在抗结核杆菌感染免疫反应中发挥重要作用。鉴定结核抗原的MHC I限制性CTL表位，对于阐明CD8+ T细胞在抗结核中的保护效应、深入了解抗结核免疫反应以及研发新型抗结核疫苗等具有至关重要的作用。Ag85复合体是结核杆菌表达的一种具有免疫显性的抗原蛋白，由85A、85B和85C3种高度同源的蛋白组成，与分枝杆菌的转移酶活性相关，参与合成分枝杆菌的细胞壁，能够在多数接触结核杆菌的健康人体内诱导T细胞增殖和IFN- Y释放，是结核疫苗较理想的候选抗原。Ag85B199_2OT肽是一个高度保守的结核抗原肽，具有HLA-A*0201限制性，而此等位基因在人群中的频率超过40%。Ag85B199_207肽可诱导抗结核杆菌的Thl型保护性免疫反应，使效应性T细胞表达IFN-Y和TNF-α等细胞因子发挥抗菌作用。体内实验表明，以Ag85B199_207免疫HLA-A2/Kb转基因小鼠可提高T细胞增殖水平和细胞毒性水平。
技术实现思路
本专利技术的目的在于筛选出结核肽Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)特异的TCR，利用逆转录病毒载体将其转染到⑶8+ T细胞中，获得表达结核肽Ag85B199_2OT特异TCR的⑶8+ T细胞，以及该经过TCR基因修饰的CD8+ T细胞在制备抗结核病药物中的应用。 本专利技术所采用的技术方案是 结核肽Ag85B199_2Q7特异性T细胞受体(TCR)，包括a链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ ID NO: 3所述的序列；β链的⑶R3区含有SEQ ID NO: 4所示的序列。优选的，所述结核肽Ag85B199_2OT特异性TCR的a链是由SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。优选的，所述结核肽Ag85B199_2OT特异性TCR的a链的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。编码结核肽Ag85B199_2Q7特异性TCR的基因。一种结核肽Ag85B199_2OT特异性TCR的融合基因，其序列如SEQ ID NO: 13所示。一种重组逆转录病毒载体，含有编码结核肽Ag85B199_2(l7特异性TCR的基因。一种重组逆转录病毒载体，含有SEQ ID NO: 13所示的基因。优选的，上述重组逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或 pMYx-IRES-GFP。上重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。上述逆转录病毒转染的⑶8+ T细胞。结核肽Ag85B特异性TCR，编码该TCR的基因，含有该基因的重组逆转录病毒载体、逆转录病毒，该逆转录病毒转染的CD8+ T细胞在制备抗结核病药物中的应用。实现上述技术方案具体步骤流程如下 I、筛选结核肽 Ag85B199_2Q7 (KLVANNTRL)特异的 TCR ①采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个 核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)； ②计数PBMC，调整PBMC数目为IX IO6/孔，每孔细胞分别加入含结核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)的 10% FBS-1640 培养基 2ml ； ③贴壁培养2h后，加入25U/mlIL-2,第3天补加IL-2至50U/ml，第5天本文档来自技高网...
【技术保护点】
结核肽Ag85B199–207特异性T细胞受体（TCR），包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQ？ID？NO:？3所述的序列；β链的CDR3区含有SEQ？ID？NO:？4所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马骊，郝佩佩，温茜，罗微，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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