本发明专利技术公开了一种具有双重结合活性的抗MRSA-PBP?2a的单克隆抗体。该单克隆抗体对MRSA菌表达的PBP?2a蛋白抗原表位具有特异的高亲和力，而对MSSA表达的PBP?2a蛋白不能特异性结合，从而能区分MRSA菌和MSSA菌。所述的单克隆抗体能够特异性结合S.aureus表达的PBP?2a蛋白的27-46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY氨基酸片段和375-400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS氨基酸片段以及两者的结合的抗原表位。本发明专利技术将应用于医学技术、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属单克隆抗体
(生物医学
)，特别是，实验已证实了一种能够特异性识别金黄色葡萄球菌(MRSA)抗原表位，并可区分MRSA和MSSA的单克隆抗体。
技术介绍
MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus),即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是全球性导致病人感染的最重要的耐药致病菌之一 此菌对常用的多种抗生素广泛耐药，其中包括甲氧西林，其主要耐药机制是由于MRSA菌体产生的青霉素结合蛋白2a(Penicillin Binding Protein 2a, PBP 2a),蛋白分子量为 75kDa ;此蛋白由菌体染色体，即mecA基因编码，大量实验证实，PBP2a对β -内酰胺类抗生素呈现低亲和力的结合，从而导致耐药性。依据本菌对抗生素的耐药性和敏感性，在临床上分为MRSA和MSSA(对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌)两类。
技术实现思路
制备和鉴定出能特异性且高亲和力结合MRSA的PBP 2a蛋白的两种单克隆抗体，该抗体也能进一步区别MRSA和MSSA。确定了两种单克隆抗体结合MRSA的PBP2a蛋白抗原表位，10A10. F2细胞株产生的单克隆抗体结合表位是，DKEINNTIDAIEDKNFKQVY，即位于氨基酸27 46 ；4B10. B6细胞株产生的单克隆抗体结合表位是，SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS,即位于氨基酸375 400。另一方面,本专利技术还包括一种来源于MRSA的PBP2a抗原表位,该抗原表位能与单克隆抗体特异性结合，从而用于区分MRSA和MSSA。在本专利技术的具体实例中，所述的抗原表位为S. aureus (MRSA)的PBP2a蛋白的27 46 位的 DKEINNTIDAIEDKNFKQVY 和 375 400 位的 SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。在本专利技术的具体实例中，所述的两种抗原表位包括核心氨基酸EDK。在本专利技术的具体实例中，所述的抗原表位能被4B10. B6细胞株产生单克隆抗体特异性识别。在本专利技术的具体实例中，所述的抗原表位能被10A10. F2细胞株产生单克隆抗体特异性识别。在本专利技术的另一具体实例中，还包括一种区别MSSA和MRSA的方法，步骤包括(i)分离制备耐药性及非耐药性葡萄球菌，并获取菌体培养上清及裂解液为鉴定样品；(ii)将能够与MRSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位结合而不能与MSSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位结合的单克隆抗体与生物样本作用，所述的单克隆抗体还具有能够区分MRSA和MSSA菌的特性；(iii)检测单克隆抗体与生物样本的结合物，由此，鉴定生物样本中的MRSA菌。在本专利技术的具体实例中，所述的单克隆抗体为鉴定的4B10. B6细胞株产生。在本专利技术的另一具体实施例中，所述的单克隆抗体为鉴定的10A10.F2细胞株产生。附图说明为使更加容易理解本专利技术，下面结合附图，进一步阐述本专利技术。图I.鼠抗MRSA单克隆抗体与培养的MRSA细胞蛋白特异结合的免疫印迹分析。样品经12 % SDS-PAGE电泳分析，I. MRl (15 μ L/泳道);2· MSl (15 μ L/泳道)；3.Ε. coli (15 μ I/ 泳道)；4. MR2 (15 μ I/ 泳道)；5. MS2 (15 μ I/ 泳道)；6. Protein Marker,MRl和MR2来源于MRSA菌，MSl和MS2来源于MSSA菌。图2A和2B.鼠抗MRSA单克隆抗体与体外表达的PBP2a蛋白结合免疫印迹分析。2A 1. Marker ；2. PBP2a(2 μ g/ 泳道);3· MRl (15 μ L/ 泳道)。 2Β 1. PBP2a(2 μ g/lane) ；2. PBP2a(0. 2 μ g/Lane)，3. MRl (15 μ L/ 泳道)。图3.显示单克隆抗体4bl0. b6与合成肽抗原1733和1734的结合。包被抗原(IOOng/孔)，非相关肽作为对照，常规包被96孔板，4°C包被过夜，封闭液封闭I小时，加入抗体的系列稀释液，然后加入过氧化物酶标记的抗鼠二抗(I 20，000)检测。图4A和4B显示单克隆抗体与肽1733和1734的结合作用能被竞争ELISA所抑制。两图均显示抗体与肽1733和1734的结合作用被竞争性抑制。IOOng每孔包被抗原，将非相关性肽作为对照肽加入96孔板，4°C过夜，封闭液封闭I小时，加入抗体的系列稀释液，然后加入过氧化物酶标记的抗鼠二抗(I 20，000)检测。图5.阐明选择抗体的竞争结合斑点杂交分析。两种纯化后的抗体与抗原1733和1734结合。MRSA实验对照抗体特异的单克隆抗体抗MRSA单抗仅能与1733结合，抗PBP2a单克隆抗体既能与1734结合，也能与整个表达蛋白相结合。图6A-6D.抗体结合样品中抗原的免疫印迹分析。6A 4B10. B6克隆(亚型IgGl) ；6B : 10A10克隆(亚型IgM) ；6C :供应商提供的抗MRSA单克隆抗体；6D :商业购买的抗PBP2a单克隆抗体。l.Marker ；2. MRSA ；3.MSSA ；4. SEPl ；5. E. coli。图7A和7B.单克隆抗体能特异性沉淀MRSA裂解液中的蛋白。7A :染色SDS-PAGE ；7B:特异性测定。检测先将MRSA菌与4B10.B6抗体共同孵育，然后再与抗鼠磁珠孵育；洗脱的混合物加入SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白转印膜经生物素标记的10A10. F2抗体和Streptavidin-HRP 系统检测，I. Marker ;2. MRSA 样本 + 沉淀抗体(15 μ I/ 泳道)；3.MSSA 样本+沉淀抗体(15 μ I/泳道)。图8. PBP2a蛋白的氨基酸序列。本专利技术的单克隆抗体识别的抗原表位区域用下划线标出。图9.两种抗体与MRSA的结合位点。以下的描述和实例将对以上附图进行更详细的说明。为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本专利技术，即通过下面的说明、附图、具体实例和权力要求来阐明专利技术的功能、对象和优点。具体实施例方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而非限制本专利技术的范围。除非特别提出，每一居中值，应为最小界限的十个单位的每一组均值，即介于最高和最低界限范围，而且，其它数值和均值也同样列入此描述范围。除非另有说明，本专利技术所涉及的技术和科学术语是公众所理解的普通技术，任何类似或等同于此处描述的方法和材料也适宜于本公开专利技术，但现对优选方案做一描述。该说明书中引用的所有出版物和专利都包括在参考文献中，就如出版物和专利指明均要一一列出，同时，这些文献用于揭示和描述引用部分相关的方法和材料。引用的任何出版物都是在申请日期前公开的，但不要误解为承认是提前公布，现在的公开是晚于该出版物。此外，提供的出版日期可以不同于实际的出版日期，这需要另外专门来证实。本专利技术中的技术是显而易见的，此处描述说明的每一个都有独特的部分和特征，这可能比较容易地与其它几个的特征有区分或结合，而不偏离本专利技术的范围。所有引用的方法均会以有序、合理的步骤加以实施。 除非另有说明，本专利技术涉及的实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有双重结合活性的抗MRSA？PBP？2a的单克隆抗体，其生物特征型是，该单克隆抗体对MRSA菌表达的PBP2a蛋白抗原表位具有特异的高亲和结合力，而不能结合MSSA菌表达的蛋白，从而能特异性地鉴定出MRSA和MSSA两种菌。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄若磐，张英，
申请(专利权)人：广州瑞博奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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