一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺技术

本发明专利技术公开了一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺。本发明专利技术提供了一种重组人表皮生长因子受体抗体基因，并将携带重组人表皮生长因子受体抗体基因的真核表达载体转染进入CHO‑K1细胞，利用流式细胞仪多次筛选得到高表达重组人表皮生长因子受体抗体的细胞，并建立细胞株的生产工艺。本发明专利技术提供的含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株所表达的重组蛋白可对多种癌细胞表面的EGFR配体结合位点进行封闭，从而削弱或阻断EGFR下游的信号传导，达到抑制肿瘤的生长和侵袭，促进细胞凋亡的目的。在治疗EGFR过表达引起的癌症方面具有很大的应用价值，对于EGFR过表达引起的癌症治疗具有重大应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺
本专利技术涉及“一种含重组人表皮生长因子受体抗体基因的CHO细胞株、筛选方法及其生产工艺”属于生物

技术介绍
近年来，恶性肿瘤一直作为一种顽固性疾病危害着人类健康。目前，癌症的治疗主要还是以放疗和化疗为主，但放化疗给人体带来的损伤往往是不可修复的，如放射性肝、肺纤维化等。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是一种膜表面受体，其具有酪氨酸激酶活性，能够进行细胞信号传递，已有研究证实，EGFR过度表达与某些肿瘤，如非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌、乳腺癌等密切相关。在癌症患者中，通过人为干预使EGFR降低后，可以明显改善癌症患者的病情。编码表皮生长因子受体的基因位于7号染色体的短臂1区2带，隶属于表皮生长因子(erbB)家族，该家族共有四个成员：ErbB1(EGFR)、ErbB2、ErbB3、ErbB4，EGFR在许多如头颈部癌、皮肤鳞癌、食管癌、结直肠癌等实体瘤组织和器官中过度表达。EGF结合EGFR后，促使EGFR单体进行二聚化作用而形成二聚体，受体的二聚化导致胞内区的酪氨酸蛋白激酶活性激活，随后，信号传导到细胞核，通过对核内基因的转录调控，发挥相应的生物学作用。相关研究发现，EGF途径主要包括RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT通路，这两个通路作为一个复杂的网络而运行。EGFR的过度表达和活化导致胞内若干信号活化，不仅使细胞增殖达到高潮，而且对细胞凋亡、细胞迁移，血管生成等其他癌症的进展过程也至关重要。表皮生长因子受体(EGFR)的异常信号传导在恶性表型的发展和维持起着重要的作用，因此，该受体是一种合理的抗肿瘤靶点。目前，临床上针对于EGFR异常表达所引起的肿瘤所使用的治疗药物主要为小分子酪氨酸激酶拮抗剂和单克隆抗体。小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂主要为吉非替尼和埃罗替尼。目前，已批准上市的用于治疗癌症抗体药物有20种，其中，以EGFR为靶点的治疗性单克隆抗体主要为Cetuximab、Panitumumab和Nimotuzumab三种，这些EGFR单克隆抗体可以封闭EGFR胞外区对应的配体的结合位点，抑制其特有的酪氨酸激酶活性，减慢因该信号通路所引起的癌症的恶化速度。FDA批准上市的抗hEGFR抗体中，其中，Cetuximab为人鼠嵌合单克隆抗体，其虽然可以特异性的与EGFR结合，较好的抑制癌症的发展，但在人体应用的过程中往往表现出较强的免疫原性，易产生人抗鼠反应；Panitumumab是100％的人源性单克隆抗体，其采用转基因小鼠技术制备，由balb/c小鼠细胞分泌表达及修饰，鼠源修饰可造成糖基化减弱，超敏反应，半衰期短等缺点；Nimotuzumab是一种通过人源化改造的而获得的IgG1型单克隆抗体，改造过程中将鼠源IgG2a的互补决定域(CDR)移植到人的抗体结构中，大大降低了鼠源抗体成分，然而在表达载体的构建过程中，抗体的轻、重链基因被分别连至不同的载体而使之分别表达，这种方法往往会导致轻、重链的表达比例处于非均衡状态，同时降低抗体的组装效率，使具有完整结构的抗体的产率下降。本专利技术中，抗体轻、重链连接到同一表达载体peedual中，实现抗体轻、重链的共表达。全长抗体分子是由两条完整的重链和两条完整的轻链通过二硫键连接而成的四聚体蛋白，在生物表达过程中经过细胞器严格的加工修饰才能使其具有高亲和力以及与抗原特异性结合能力，因此，对其生产从质和量上的要求就更加的严格，表达系统的选择也至关重要。原核生物不含蛋白加工修饰的众多细胞器，因此，大肠杆菌表达系统只可以用于生产体积小、结构简单、不需要糖基化的抗体片断如Fab、Fab'、scFv等；低等真核生物表达系统，如酵母及丝状真菌，可用于全长抗体的生产，但其糖基化类型与人类相比存在差异，如酵母糖基化类型为多麦芽糖类型，该类型糖蛋白抗体半衰期较短、生理活性有限甚至对人体有毒性。在蛋白修饰的系统中最接近人体的是哺乳动物表达系统，该系统可以对蛋白进行适当的折叠、装配和翻译后修饰，在临床应用中占主导地位，目前，中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovarycells，CHOcells)是最理想的真核表达宿主，通过该系统表达的蛋白在构型和构象上更接近于天然蛋白，是重组糖基化蛋白生产的首选体系。目前，获FDA批准的抗体药物中许多是由CHO细胞生产的，CHO-K1细胞是可以悬浮生长的谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型细胞，因此，转染后的CHO细胞可运用共扩增基因进行筛选，即在表达载体上游加入GS基因作为筛选标记，同时利用GS抑制物甲硫胺酸亚砜(L-Methioninesulfoxide，MSX)进行加压筛选，随培养基中MSX浓度的逐渐增加，GS基因带动与之串联在一起的外源基因共同转录，使目的基因的转录效率增加，从而实现外源基因的高效表达。由于GS筛选标记不能够直观的监测及分选阳性细胞，因此，本专利技术在轻链的下游引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，EGFP是GFP的突变体，具有更高的荧光强度，在488nm波长光激发下可产生绿色荧光，从而通过流式细胞仪进行检测和分选。由于常规CHO细胞需要在有牛血清或类似成分存在的情况下贴壁生长，细胞培养基中的血清或蛋白质成分对重组蛋白在细胞中的表达以及后期的蛋白纯化过程有很大的影响。如果进行产业化，还需要首先进行无血清驯化，使细胞适应无血清培养基并在其中生长良好并持续分泌产生重组蛋白质以降低成本并方便下游纯化工艺的开发。无血清悬浮驯化技术被广泛应用于基因工程制药。一方面是为了获得能够满足生产要求的无血清细胞株；另一方面，是为了获得无血清悬浮生长的宿主细胞，为后续细胞株的开发奠定基础，常用的宿主细胞，如CHO细胞、骨髓瘤细胞。本专利技术中工程细胞驯化方法采用两个阶段的驯化过程，第一步适应无血清培养条件培养，第二步使细胞适应悬浮。
技术实现思路
本专利技术提供了一种可以稳定，高效表达anti-hEGFR的悬浮CHO-K1单克隆细胞株，可以用于hEGFR抗体的产业化生产，得到的anti-hEGFR可以封闭EGFR胞外区对应的配体的结合位点，抑制其特有的酪氨酸激酶活性，减慢因该信号通路所引起的癌症的恶化速度。本专利技术提供的稳定，高效表达anti-hEGFR的悬浮CHO-K1单克隆细胞株，由不含内毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR质粒转染进入CHO-K1细胞株，并通过甲硫胺酸亚砜加压和流式细胞仪多次筛选、流式细胞仪分选单克隆后悬浮驯化得到。本专利技术还提供了稳定，高效表达anti-hEGFR的悬浮CHO-K1单克隆细胞株悬浮培养的生产工艺，即37℃、5％CO2、150rpm培养8天，分别于第3天、第5天和第7天补加10％培养体积的含1g/LPluronicF-68OptiCHO无血清培养基，培养结束后收集上清，得到anti-hEGFR。附图说明图1为转染前后的CHO-K1细胞图2为转染后的经MSX加压CHO-K1细胞图3为转染后CHO-K1阳性细胞的筛选图4为单克隆细胞阳性率检测图5为单克隆细胞的DotBlot检测图6为表达anti-EGFR重组蛋白的悬浮细胞和贴壁细胞形态图7为悬浮培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有重组人表皮生长因子受体抗体基因(质粒为Peedual‑IRES‑EGFP‑hEGFR)的CHO悬浮细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种含有重组人表皮生长因子受体抗体基因(质粒为Peedual-IRES-EGFP-hEGFR)的CHO悬浮细胞株。2.根据权利要求1所述的CHO细胞株，其宿主细胞为CHO-K1。3.根据权利要求1所述的质粒Peedual-IRES-EGFP-hEGFR，其包含IRES(内部核糖体进入位点)序列、EGFP(增强型绿色荧光蛋白)序列和EGFR(重组人表皮生长因子受体抗体)序列。4.根据权利要求3所述的质粒，其中EGFP编码基因序列为SEQIDNO:1所示，氨基酸序列为SEQIDNO:2所示；IRESEGFP片段编码基因序列为SEQIDNO:3所示。EGFR包括LC和HC片段，其中LC编码基因序列为SEQIDNO:4所示，氨基酸序列为SEQIDNO:5所示；HC编码基因序列为SEQIDNO:6所示，氨基酸序列为SEQIDNO:7所示。5.根据权利要求1-4任一所述的CHO细胞株的构建方法，包括以下步骤：(1)提取重组质粒Peedual-IRES-EGFP-hEGFR；(2)将质粒转入CHO-K1中。取纯化后且不含内...

【专利技术属性】
技术研发人员：任桂萍，李德山，张胜奇，刘春香，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23