一种高效基因编辑快速制备PD-1-T细胞方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种获得PD‑1ˉT细胞的方法，包括以下步骤：（1）获取人外周血T淋巴细胞；（2）质粒转染；（3）融合细胞的制备；（4）PD‑1ˉ肿瘤特异性T细胞的扩增。本发明专利技术还公开了该获得PD‑1ˉT细胞的方法的应用，利用本发明专利技术方法获得的PD‑1ˉT细胞排除了负抑制性调节受体，具有很好的抗肿瘤效应，相比传统过继治疗的细胞有效延长了荷瘤小鼠的生存时间，适合医学领域的推广。

A highly efficient gene editing method for rapid preparation of PD-1-T cells and its application

The present invention discloses a method for obtaining PD 1 - T cells, including the following steps: (1) obtaining human peripheral blood T lymphocytes; (2) plasmid transfection; (3) preparation of fused cells; (4) amplification of PD 1 - tumor specific T cells. The invention also discloses the application of the method for obtaining the PD 1 - T cell. The PD 1 - T cells obtained by this method have excluded the negative inhibitory regulatory receptor, and have good antitumor effect. Compared with the traditional adoptive cells, the cells effectively prolong the survival time of the tumor bearing mice, and are suitable for the promotion of the medical field.

【技术实现步骤摘要】
一种高效基因编辑快速制备PD-1-T细胞方法及其应用
本专利技术属于生物医学领域，尤其是涉及一种高效基因编辑快速制备PD-1-T细胞方法及其应用。
技术介绍
机体免疫系统中的T细胞是淋巴细胞的主要构成部分，T淋巴细胞主要用来抵抗外来入侵物且具有多样的生物学功能。它是机体进行对抗疾病的入侵、感染以及肿瘤形成的主要“战士”。目前，肿瘤治疗的方法一般为手术、放疗和化疗，在这些方法中存在一些问题，其中过继治疗中会出现免疫逃逸现象，影响抗肿瘤效应。PD-1（programmeddeath1）即程序性死亡受体1是一种负性抑制性的调节受体，当T细胞活化后可明显使PD-1表达上升，通过与配体PD-L1的联合作用可明显抑制T细胞的活化和细胞增殖能力，影响T细胞分泌各种细胞因子的能力。通过封闭或者敲除这类分子,可助于肿瘤免疫激活，已有报道采用抗体封闭PD-1或使用PD-1抑制剂进行治疗，是很有前景的肿瘤免疫辅助治疗方法。而在实验中发现，使用阻断剂或PD-1抑制剂时也存在一些弊端如抗体具有免疫原性且费用较高。因此寻找一种高效且成本适中的方法至关重要。CRISPR/Cas9（ClusteredRegμlarlyInterspacedShortPalindromicRepeats）基因技术是近两年来新出现的一种生物技术，通过人工设计RNA形成sgRNA指导Cas9蛋白在靶位点定点切割DNA,是目前生物医学领域研究的一大热点。现在诱导特异性T淋巴细胞的方法多采用融合细胞刺激，因此本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除T细胞上PD-1受体基因，在体内外进一步验证融合细胞诱导的特异性T细胞的抗肿瘤作用。但是现有的CRISPR/Cas9基因技术尽管在许多领域得到了运用，也表现出了很好的效果，但是在肿瘤治疗方面，特别是敲除T细胞上的PD-1基因上在公开技术中并没有涉及，此外，现有的CRISPR/Cas9敲除PD-1基因技术并没有发现有联合应用高穿透肽小分子TAT，这样就存在质粒转染效率和PD-1基因编辑效率较低的问题。因此，在使用CRISPR/Cas9基因技术敲除PD-1基因的基础上使用融合细胞诱导的特异性PD-1-T细胞具有抗肿瘤作用，并且联合应用高穿透肽小分子TAT为肿瘤的免疫治疗提供了一种新的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对上述存在的问题，提供一种高效基因编辑快速制备PD-1ˉT细胞方法及其应用，本专利技术的方法可有效敲除PD-1基因，显著提高质粒转染效率与PD-1基因编辑效率以获得特异性PD-1ˉT细胞，产生抗肿瘤效应，运用于肿瘤治疗中。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的一种高效基因编辑快速制备PD-1ˉT细胞方法，包括以下步骤：1）获取人外周血T淋巴细胞：取外周血100ml，用等量PBS稀释血液后缓慢加入淋巴细胞分离液，离心，弃血清，将白膜层中单个核细胞吸出于新的离心管中，离心，弃上清，用15~30mlPBS洗三次；用不完全1640重悬置于培养箱中，1.5~2.5h细胞贴壁后，吸取悬浮的细胞，过尼龙绵柱后得到T淋巴细胞。2）质粒转染：将步骤1）所得T淋巴细胞调整浓度为1×107/ml，质粒调整为相同浓度，分别吸取90~120μl细胞悬液、2~5μl质粒与2~10μl高穿透力小分子引导肽TAT水溶液均匀混合后吸入无菌的电转杯，电转后快速将细胞转移至12孔板中并加入2ml预热的完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱继续培养，即可完成质粒转染，得到PD-1ˉT细胞。3）融合细胞的制备：向步骤（1）中的贴壁细胞中加入GM-CSF1000M/ml、IL-4500M/ml诱导出DC细胞，然后靶细胞HepG2，使用分子量为1450的PEG诱导DC/HepG2融合。4）PD-1-T肿瘤特异性T细胞的扩增：使用步骤（3）所得DC/HepG2融合诱导步骤（2）中完成质粒转染的PD-1ˉT细胞增殖。进一步地，在步骤（1）中，所述外周血用等量PBS稀释加入淋巴细胞分离液离心后分为四层，从上到下依次是血清、白膜层、分离液、红细胞，所述离心条件为在1500~2000rpm下，离心10~15min。进一步地，所述质粒为px330-PD-1-gRNA质粒，所述px330-PD-1-gRNA质粒的构建方法为根据PD-1基因的CDS区设计gRNA，用BBSI酶切pX330质粒将gRNA和线性化的pX330质粒通过T4连接酶连接，之后转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序，筛选出重组入sgRNA的pX330-PD-1-gRNA质粒，进行单克隆菌的扩增，提取质粒。进一步地，所述电转杯的电转条件设置为210V，20ms、310V，20ms、410V，20ms。进一步地，所述完全培养基为DMEM培养基，并加以10%的胎牛血清和100M/ml的抗生素。本专利技术还提供了一种高效基因编辑快速制备PD-1ˉT细胞方法在抗肿瘤中应用。更进一步地，所述肿瘤为实体肿瘤，该实体肿瘤为肝癌、肺癌、肠癌、前列腺癌、胰腺癌和肺腺癌的一种或几种。更进一步地，所述步骤2）的电转杯，包括杯子和杯盖，所述杯盖的上方还设有能够将杯子内腔清洗干净以及消毒烘干的清洗烘干器，所述杯盖包括盖体以及设于盖体上部的凸起，所述清洗烘干器的底部设有与凸起相互配合的凹槽，所述清洗烘干器通过底部的凹槽与盖体的凸起紧密连接，所述杯子包括杯体以及设于杯体内的正、负电极，在所述正、负电极外圈的两侧还分别设有导电体，在所述两侧导电体还设有连接导线，所述正、负电极通过导电体与连接导线与外部的电转仪电性连接，所述的清洗烘干器包括左、右封板、上盖板和下托板而围成的箱式结构，在所述箱式结构的任一封板内安装有铰接座，在所述的铰接座上连接有铰接轴，所述铰接轴伸出的一端连接有伸缩管，所述伸缩管的另一端还连接有加热棒，所述清洗器开关上连接有导线与插头，在所述加热棒的外圆周上安装有毛刷，在所述伸缩管上设有能够使得加热棒加热或毛刷旋转的清洗器开关，所述的安装有铰接座的封板与上盖板以及封板与下托板之间均安装有活页。本专利技术所述的外周血采自健康志愿者，所述淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品公司。综上所述，由于采用上述技术方案，本专利技术相比现有技术所具有的突出的实质性特点和显著的进步是：（1）将CRISPR/Cas9基因技术运用于T细胞中PD-1基因的敲除，特异性好。本专利技术利用CRISPR/Cas9基因技术成功构建出sgRNAs，利用电穿孔技术将此px330-PD-1-gRNA质粒转染至人外周血来源的T淋巴细胞并进行敲除T细胞上的PD-1基因，所获得的PD-1-T细胞阻断了负抑制性的调节受体，具有更好的肿瘤抑制活性。（2）将经过基因敲除的T细胞用融合细胞扩增，抗肿瘤效应更强。本专利技术利用PEG化学法进行DC/HepG2的融合，用融合细胞诱导出特异性的PD-1-T淋巴细胞，根据本专利技术实验来看，所诱导出的特异性的PD-1-T淋巴细胞在荷人肝癌SCID鼠体内通过抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡来延缓肿瘤的生长，从而延长荷瘤小鼠的生存时间，说明诱导细胞抗肿瘤效应更强，适合医学推广。（3）运用TAT，提高基因编辑效率：本专利技术在质粒转染的过程中使用了高穿透力小分子引导肽TAT，高穿透力小分子引导肽TAT与质粒混合后，再转染T细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效基因编辑快速制备PD‑1ˉT细胞方法，其特征在于，包括以下步骤：1）获取人外周血T淋巴细胞：取外周血100ml，用等量PBS稀释血液后缓慢加入淋巴细胞分离液，离心，弃血清，将白膜层中单个核细胞吸出于新的离心管中，离心，弃上清，用15~30mlPBS洗三次；用不完全1640重悬置于培养箱中，1.5~2.5h细胞贴壁后，吸取悬浮的细胞，过尼龙绵柱后得到T淋巴细胞；2）质粒转染：将步骤1）所得T淋巴细胞调整浓度为1×10

【技术特征摘要】
1.一种高效基因编辑快速制备PD-1ˉT细胞方法，其特征在于，包括以下步骤：1）获取人外周血T淋巴细胞：取外周血100ml，用等量PBS稀释血液后缓慢加入淋巴细胞分离液，离心，弃血清，将白膜层中单个核细胞吸出于新的离心管中，离心，弃上清，用15~30mlPBS洗三次；用不完全1640重悬置于培养箱中，1.5~2.5h细胞贴壁后，吸取悬浮的细胞，过尼龙绵柱后得到T淋巴细胞；2）质粒转染：将步骤1）所得T淋巴细胞调整浓度为1×107/ml，质粒调整为相同浓度，分别吸取90~120μl细胞悬液、2~5μl质粒与2~10μl高穿透力小分子引导肽TAT水溶液均匀混合后吸入无菌的电转杯，电转后快速将细胞转移至12孔板中并加入2ml预热的完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱继续培养，即可完成质粒转染，得到PD-1ˉT细胞；3）融合细胞的制备：向步骤1）中的贴壁细胞中加入GM-CSF1000M/ml、IL-4500M/ml诱导出DC细胞，然后靶细胞HepG2，使用分子量为1450的PEG诱导DC/HepG2融合；4）PD-1ˉ肿瘤特异性T细胞的扩增：使用步骤3）所得DC/HepG2融合诱导步骤（2）中完成质粒转染的PD-1ˉT细胞增殖。2.根据权利要求1所述一种高效基因编辑快速制备PD-1ˉT细胞方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述外周血用等量PBS稀释加入淋巴细胞分离液离心后分为四层，从上到下依次是血清、白膜层、分离液、红细胞，所述离心条件为在1500~2000rpm下，离心10~15min。3.根据权利要求1所述一种高效基因编辑快速制备PD-1ˉT细胞方法，其特征在于，所述质粒为px330-PD-1-gRNA质粒，所述px330-PD-1-gRNA质粒的构建方法为根据PD-1基因的CDS区设计gRNA，用BBSI酶切pX330质粒将gRNA和线性化的pX330质粒通过T4连接酶连接，之后转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序，筛选出重组入sgRNA的pX330-PD-1-gRNA质粒，进行单克隆菌的扩增，提取质粒。4.根据权利要求1所述一种高效基因编辑快...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，周素芳，李桂银，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45