一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法技术

本发明专利技术属于细胞领域，具体涉及一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，包括如下步骤，S1、从血液标本中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；S2、将含有至少一种潜能性决定因子的游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；S3、将S2中获取的包含游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得所述的潜能性决定因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA‑1‑60与TRA‑1‑81表达激活的细胞，该细胞即为诱导多能干细胞。本发明专利技术的有益效果是可以高效诱导产生无外源基因成分的多能干细胞，适用于临床前研究和临床应用。

【技术实现步骤摘要】
一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法
本专利技术属于细胞领域，具体涉及一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法。
技术介绍
脊椎动物胚胎发育早期囊胚的内细胞团具有多能性，其可以分化为机体除胎盘之外三胚层的所有类型细胞，这些已经终端分化的细胞在体内一般是不会改变命运的。一些研究表明，通过核移植，细胞融合和多能性细胞提取物共培养的方法可以实现终端分化的细胞重新逆分化为多能性的状态，但这些方法依赖于稀缺的卵母细胞或已有的多能干细胞，因此在应用上受到很大的限制。2006年，日本京都大学Yamanaka研究小组利用逆转录病毒载体，将外源性的Pou5f1、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子在小鼠成纤维细胞中过表达，在小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)的培养条件下获得了Fbx15+的多能干细胞系，该细胞系在细胞形态、生长特征、表面标志物、形成畸胎瘤等方面与小鼠ESC非常相似，而在基因表达谱、DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠ES细胞，故将其命名为诱导多能干细胞(inducedPluripotentStemCell,iPSC)。(TakahashiK1,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell.2006；126:663-676)2007年7月,Yamanaka研究小组进一步用Nanog代替Fbx15蛋白进行筛选，得到了Nanog+的iPSC，该iPSC不仅在细胞形态、生长特征、标志物表达、移植到小鼠皮下可形成包含3个胚层组织细胞结构的畸胎瘤等方面与小鼠ESC非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与小鼠ESC几乎完全相似。此外，研究还发现重新激活外源致癌基因c-Myc是嵌合体动物出现肿瘤形成的原因；而转染的上述4个基因在iPSC中并没有表达，表明这些基因只在诱导过程中起作用，iPSC保持多潜能性状态的原因是内源性转录因子，如Nanog等基因的表达。(OkitaK1,IchisakaT,YamanakaS.Generationofgermline-competentinducedpluripotentstemcells.Nature.2007；448:313-317.)2007年11月，Yamanaka研究组使用了同样的方法获得了人类诱导多能干细胞hiPSC,同时，威斯康辛大学Thomson研究小组也报道了成功诱导成纤维细胞转化为具有人类胚胎干细胞hESC基本特征的hiPSC，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择出了POU5F1、SOX2、NANOG、LIN28A等4个基因进行转导。(Yu,J.,etal.，Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science.2007；318:1917-1920)2008年，ParkIH.,etal.利用来自胎儿、新生儿及成人的皮肤或肺部的原代成纤维细胞，其中包括来自1名健康男性皮肤活检得到的成纤维细胞，采用Yamanaka研究小组的策略也获得了相同的结果。他们还发现POU5F1和SOX2在hiPSC诱导重编程中是必需的，正是这两个转录因子激活、维持了内源多潜能性因子的表达，而KLF4和c-MYC的作用是改变染色质的结构，从而有利于POU5F1和SOX2的结合，以提高诱导的效率。此外，该项研究的重要意义在于将取自皮肤活检的成纤维细胞诱导为hiPSC。上述研究表明，从活检人类皮肤组织中提取体细胞后进行诱导以制备患者特异性的干细胞是可行的，因而有望克服细胞移植治疗中存在的免疫排斥反应。(ParkIH.,etal.，Reprogrammingofhumansomaticcellstopluripotencywithdefinedfactors.Nature.2008；451:141-146)由于向供体细胞转导外源基因使用的病毒/质粒载体会在重编程过程中对其产生一定影响，通过此类方法筛选获得的克隆中存在基因重排、核型异常、表观遗传学异常等现象，甚至具有高危致癌几率。2008年，Okita等人通过多次常规质粒转染的方法获得了小鼠iPSC,但操作麻烦、重编程效率低下。同年，Stadtfeld等人首次使用由腺病毒载体衍生的复制缺陷型载体生成无整合的iPSC。他们成功地在小鼠肝脏细胞中表达此种载体携带的外源OSKM基因，并得到了无外源基因整合的iPSC。但是在重编程小鼠胎儿肝细胞及成体成纤维细胞时，必须在稳定反式表达外源Oct4基因的前提下转染携带SKM基因的载体，才能得到iPSC。2009年，Fusaki团队利用基于仙台病毒(Sendaivirus，一个RNA病毒)的载体将不同类型的终末分化细胞重编程为hiPSC。但这种方法的诱导获得的iPSC内仍然含有此病毒载体，并且在多次传代后仍然可能在细胞内存在，不易删除。在多次传代后筛选到的不含此载体的iPSC克隆由于长时间异位表达Myc基因，可能会导致其核型异常。另外Zhou等人于2009年以蛋白质OSKM与一个精氨酸的细胞膜转导结构域融合，在大肠杆菌中表达并提纯了融合蛋白、将这些融合蛋白转导入含Oct4-GFP报告基因的MEF中，获得了绿色荧光蛋白阳性的克隆，这种方法避免将外源性基因材料引入重编程细胞中，但最大缺陷在于效率低下，重编程所需时间长，并且需耗费很大精力用以提纯高剂量的融合蛋白。Jia等人利用Minicircle载体从人类脂肪来源的间充质干细胞获得了非整合iPSC,但需要多次转染，操作比较麻烦，效率提高有限。(Okita,K.,etal.Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.Science2008；322(5903):949-53；Stadtfeld,M.,etal.Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science2008；322(5903):945-9；Fusaki,N.,etal.Efficientinductionoftransgene-freehumanpluripotentstemcellsusingavectorbasedonSendaivirus,anRNAvirusthatdoesnotintegrateintothehostgenome.ProcJpnAcadSerBPhysBiolSci2009；85(8):348-62.Zhou,H.,etal.Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins.CellStemCell2009；4(5):381-4.Jia,F.,etal.AnonviralminicirclevectorforderivinghumaniPScells.NatMethods2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，其特征在于，包括如下步骤，S1、从血液标本中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；S2、将含有至少一种潜能性决定因子的游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；S3、将S2中获取的含有游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得潜能性决定因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA‑1‑60与TRA‑1‑81表达激活的细胞，该细胞即为诱导多能干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，其特征在于，包括如下步骤，S1、从血液标本中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；S2、将含有至少一种潜能性决定因子的游离型载体导入S1中获取的红细胞祖细胞；S3、将S2中获取的含有游离型载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；S4、待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基维持培养，获得潜能性决定因子表达消失且内源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60与TRA-1-81表达激活的细胞，该细胞即为诱导多能干细胞。2.根据权利要求1所述的一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，其特征在于，所述血液标本来源于脊椎动物。3.根据权利要求2所述的一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，其特征在于，所述血液标本为人类血细胞。4.根据权利要求3所述的一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，其特征在于，所述人类血细胞取自人外周血、新生儿脐带血、人骨髓血中的任意一种。5.根据权利要求1所述的一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，其特征在于，所述的游离型载体为含有一个或多个潜能性决定因子的非染色体整合的DNA游离型载体。6.根据权利要求5所述的一种血液细胞的高效诱导多能干细胞重编程方法，其特征在于，所述非染色体整合的DNA游离型载体为包含DNA复制启动子和作用于上述DNA复制启动子的反式作用因子；所述的DNA复制启动子来源于...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞君英，张健，董成友，孟晨，吴文青，张颖，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34