一种表达重组神经营养因子融合蛋白的方法、重组神经营养因子融合蛋白及其应用技术

本发明专利技术提供了一种表达重组神经营养因子融合蛋白的方法、重组神经营养因子融合蛋白及其应用，属于功能蛋白技术领域。本发明专利技术通过构建高表达载体，使用细胞表达系统，筛选高表达细胞株，获得了高生物学活性、二聚体GDNF/BDNF重组蛋白，解决了市面上重组GDNF/BDNF表达量低、价格昂贵、生物学活性低等缺点。获得的GDNF/BDNF对于后续神经生长和发育等方面的基础研究与临床级细胞培养具有非常重要的意义。础研究与临床级细胞培养具有非常重要的意义。础研究与临床级细胞培养具有非常重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种表达重组神经营养因子融合蛋白的方法、重组神经营养因子融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于功能蛋白
，具体涉及一种表达重组神经营养因子融合蛋白的方法、重组神经营养因子融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]1993年Lin,L F等人利用寡聚核苷酸探针从大鼠神经胶质瘤细胞系B49细胞中发现及对人的基因文库的筛选，分离克隆出一种神经营养因子，命名为胶质源性神经营养因子(GDNF)(Lin LT et al.,1993)。GDNF是由脑组织中的神经胶质细胞分泌的具有重要生物功能的神经细胞营养因子，属于TGF
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beta超家族的一员，具有促进神经元生长和分化的作用，对多巴胺能神经元和运动神经元显示出潜在的神经营养作用(Henderson et al.,1994)，在参与神经细胞程序性死亡、促进神经元存活、参与轴突损伤的修复等方面也有重要作用(王运良，2004)。
[0003]国内外对GDNF的功能进行了广泛的研究，胚胎期GDNF可以促进神经系统的发育，成年时，GDNF可以修复神经炎症、损伤、退行性病变。Sun M等应用单纯性疱疹病毒载体表达GDNF，在帕金森氏病鼠动物模型上，定向注入脑纹状体，发现GDNF对于小鼠具有明显的行为纠正作用(Sun M,et al.,2005)。对帕金森患者的单侧豆状核注入GDNF的研究显示，有显著的、持续性的双侧症状改善效果，且无明显的不良反应(Slevin JT et al.,2006)。
[0004]GDNF是一个含有二硫键的同源二聚体分泌型蛋白质。其前蛋白是含有18个氨基酸残基的信号肽序列，蛋白加工后的成熟蛋白含有134个氨基酸残基，含有两个糖基化位点。具有生物活性的蛋白二聚体的分子量约为32～42kD，单体分子量为18～22kD，生物活性较低。由于GDNF在组织中含量较低，靠生物提取无法大量获得，所以通过基因工程方法获得具有生物学活性的GDNF显得尤其重要。蛋白表达包括原核表达系统和真核表达系统，原核表达系统虽然操作简单，可容纳基因片段大，生产成本低，但是真核表达系统能够更好的保持蛋白生物学活性，保留糖基化、二硫键等生物学特征。
[0005]另一神经营养因子，脑细胞源性神经营养因子(BDNF，下同)是由脑细胞产生、分泌的一种重要生物功能的神经细胞营养因子。BDNF对中枢和外围的多种神经细胞具有较为广泛的神经营养作用，如促进某些神经群的生存和分化，调控神经突轴的轫力，并与海马的学习、记忆以及脊髓痛疼机制有关等。更重要的是，BDNF对多巴胺能神经元的生存和生长有重要作用。它具有阻止凋亡细胞的死亡，增加络氨酸水解酶阳性神经元的生存和此神经元纤维的生长。因此BDNF作为一种强效神经保护因子被认为治疗某些中枢神经系统疾病的一个好的候选因子。
[0006]由于上述两种神经营养因子在体内表达生成较少或缺少，因此，通过体外生产获得大量、活性高的神经营养因子是本领域医药领域的迫切需求。目前，利用重组表达实现体外生产神经营养因子已经有相关报道，例如利用大肠杆菌原核表达神经营养因子属于较为常用的方法(参见CN 107793485、CN 101775072A和CN 101775072A)，然而原核表达生产神
经营养因子存在需诱导表达、包涵体表达后需多步纯化，操作繁琐，而且表达量较低、活性低。目前也有采用真核表达系统重组表达神经营养因子的报道，例如，公开号为CN 1364812A、名称为人胶质细胞衍生的神经营养因子及其衍生物及应用的中国专利报道了采用表达载体pSVT7将靶基因转染到CHO细胞中，筛选表达GDNF的细胞株，然后通过肝素亲和层析、离子交换层析等进行纯化，不仅操作繁杂，而且产量较低。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达重组神经营养因子融合蛋白及制备方法，具有稳定高表达的特点，且分离纯化操作简便。
[0008]本专利技术的目的还在于提供重组神经营养因子融合蛋白，不仅接近天然蛋白的二聚体结构而且还具有较高生物活性，为后续制备相关药物提供了优质材料。
[0009]本专利技术提供了一种重组神经营养因子的融合基因，包括神经营养因子基因序列、分泌信号肽TPA基因序列和Fc基因序列。
[0010]优选的，所述重组神经营养因子的融合基因为分泌信号肽TPA基因序列
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Fc基因序列
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神经营养因子基因序列或分泌信号肽TPA基因序列
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神经营养因子基因序列
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Fc基因序列。
[0011]优选的，所述神经营养因子为GDNF或BDNF；
[0012]所述GDNF的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，所述BDNF的核苷酸序列如SEQ ID NO:8。
[0013]优选的，所述分泌信号肽TPA基因序列如SEQ ID NO:9，所述Fc基因序列如SEQ ID NO:10。
[0014]优选的，重组GDNF的融合基因为TPA基因序列
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Fc基因序列
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GDNF基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
[0015]重组BDNF的融合基因为TPA基因序列
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BDNF基因序列
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Fc基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0016]本专利技术提供了一种重组表达载体，包含所述融合基因。
[0017]优选的，骨架载体为pPBml
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PNCE。
[0018]本专利技术提供了一种重组细胞，包含所述融合基因或所述重组表达载体。
[0019]优选的，所述重组细胞为HEK293细胞。
[0020]本专利技术提供了一种制备所述重组神经营养因子融合蛋白的方法，包括以下步骤：
[0021]1)构建含所述融合基因的重组表达载体；
[0022]2)将步骤1)中所述重组表达载体转化至哺乳动物细胞中，从获得的重组细胞中筛选高表达细胞株进行培养，分离上清液，经纯化得到重组表达神经营养因子融合蛋白。
[0023]优选的，所述筛选高表达细胞株的方法包括用Anti
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Fc Elisa检测试剂盒检测融合蛋白表达量，选择一株蛋白表达量最高的细胞株进行培养。
[0024]优选的，所述纯化是用ProteinA柱进行纯化，用含Igepal CA
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630的Loading buffer去除蛋白中的内毒素。
[0025]优选的，所述Igepal CA
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630的质量浓度为0.1～2％。
[0026]优选的，所述含Igepal CA
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630的Loadingbuffer的流速为0.4～2mL/min。
[0027]本专利技术提供了一种所述重组神经营养因子的融合基因编码的融合蛋白，所述融合
蛋白为二聚体；所述融合蛋白包括神经营养因子和Fc结构。
[0028]本专利技术提供了所述重组表达神经营养因子融合蛋白在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码重组神经营养因子的融合基因，其特征在于，包括神经营养因子基因序列、分泌信号肽TPA基因序列和Fc基因序列。2.根据权利要求1所述融合基因，其特征在于，所述重组神经营养因子的融合基因为分泌信号肽TPA基因序列
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Fc基因序列
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神经营养因子基因序列或分泌信号肽TPA基因序列
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神经营养因子基因序列
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Fc基因序列。3.根据权利要求2所述融合基因，其特征在于，所述神经营养因子为GDNF或BDNF；所述GDNF的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，所述BDNF的核苷酸序列如SEQ ID NO:8。4.根据权利要求3所述融合基因，其特征在于，所述分泌信号肽TPA基因序列如SEQ ID NO:9，所述Fc基因序列如SEQ ID NO:10。5.根据权利要求4所述融合基因，其特征在于，重组GDNF的融合基因为TPA基因序列
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Fc基因序列
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GDNF基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；重组BDNF的融合基因为TPA基因序列
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BDNF基因序列
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Fc基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。6.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1～5任意一项所述融合基因。7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，骨架载体为pPBml
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PNCE。8.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求1～5任意一项所述融合基因或权利要求6或7所述重组表...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永强，甘振磊，俞君英，张颖，胡青松，焦璐琰，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：