一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用。本发明专利技术公开了一种中脑多巴胺能神经前体细胞，其表达Lmx1a+、Foxa2+、En1+和Otx2+，其中所述中脑多巴胺能神经前体细胞不表达Nkx2.1、DBX1和GBX2中的一种或者多种。制备该中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包括以下步骤：形成拟胚体、得到中脑底板细胞和得到中脑多巴胺能神经前体细胞。该制备方法能够快速高效的从人多能干细胞分化获得中脑多巴胺能神经细胞，解决了现有的分化方法时间较长、效果不稳定、效率低及利用了含血清的培养体系或滋养层细胞不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用
[0001]本申请为申请号201910169525.0、申请日2019年03月06日、专利技术名称“一种中脑多巴胺能神经前体细胞及其制备方法和应用”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用。

技术介绍

[0003]帕金森病是最为普遍的神经退行性疾病之一，主要影响中老年人。其症状表现为静止时手、头或嘴非自主地震颤，肌肉僵直、运动缓慢以及姿势平衡障碍等。帕金森病的病因目前仍不明确，但它最主要的病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元发生大量选择性丢失，引起多巴胺合成和分泌不足。脑内需要多巴胺来指挥肌肉的运动，缺乏足够的多巴胺就会影响动作技能、语言能力以及其他功能。帕金森病目前的治疗主要靠左旋多巴制剂，但这无法治愈或逆转病情发展，并且患者需长期用药，以延缓病情进程，控制疾病。
[0004]细胞移植治疗帕金森病是通过选择适当的细胞群，移植于宿主脑组织内，替代受损的神经元以重建或恢复神经功能。帕金森患者由于中脑黑质多巴胺能神经元选择性丢失，使它更适合于细胞移植治疗。相比于ESC，iPSC可由人体皮肤、血液等体细胞在体外重编程而来，可成功地绕开了免疫排斥和伦理性两个最关键的问题，为临床上获得体外来源的中脑多巴胺能神经前体细胞进行临床移植提供了可能性。
[0005]目前已有多篇研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为中脑多巴胺能神经前体细胞的方法。较早诱导多巴胺能神经前体细胞的方法需经过神经上皮干细胞(Neuroepithelial stem cells,NES)的过程(PAX6+)，该分化过程耗时较长，且获得的细胞纯度不高(Koch et al.,2009；Falk et al.,2012)。Friling等报道在使用bFGF等细胞因子的作用下，使用拟胚体分化的方法可以先将人多能干细胞神经化，产生菊形团细胞(Rosettes)中间体结构，再通过音猥因子(Sonic hedgehog,SHH)和成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF8)的刺激获得多巴胺能神经前体细胞，该分化方法操作较为复杂，且分化过程长。虽然早期的分化方法可以诱导成功多巴胺能神经前体细胞，但是仍使用一些成分不确定或含异源成分的细胞基质或试剂，例如Matrigel和血清替代物(Knockout serum replacement,KSR)，这些成分不仅会改变细胞的一些特征，并且不同批次的Matrigel和KSR之间会有差异性，因此很难推广于临床应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术涉及一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用，该中脑多巴胺能神经前体细胞稳定性强且可以大量扩增至4
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5代，公开的制备方法能够快速高效的从人多能干细胞分化获得中脑多巴胺细胞，解决了现有的分化方法时间较长、效果不稳定、效率低及利用了含血清的培养体系或滋养层细胞不利于后续临床级细胞制剂的生产等问题。
[0007]本专利技术的具体技术方案如下：
[0008]本专利技术一方面公开了一种中脑多巴胺能神经前体细胞，其表达Lmx1a+、Foxa2+、En1+和Otx2+，其中所述中脑多巴胺能神经前体细胞不表达Nkx2.1、DBX1和GBX2中的一种或多种。
[0009]优选的，所述细胞为人细胞。
[0010]优选的，所述细胞为非贴壁细胞培养。
[0011]本专利技术第二个方面公开了一种制备上述的中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，包括以下步骤：
[0012]S1：将人多能干细胞接种于人多能干细胞维持培养基中形成拟胚体；
[0013]S2：将S1得到的拟胚体在第一分化培养基中进行分化培养得到中脑底板细胞；
[0014]S3：将S2得到的中脑底板细胞在第二分化培养基中进行分化培养得到中脑多巴胺能神经前体细胞。
[0015]应该理解，本专利技术不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本专利技术的保护范围。
[0016]优选的，所述第一分化培养基和所述第二分化培养基均包括神经诱导分化培养基。
[0017]上述神经诱导分化培养基的成分包括：DMEM/F12、Neurobasal、Glutamax、Transferrin、Insulin、Progesterone、Putrescine和Selenite。其中，DMEM/F12可作为开发无血清配方的基础，该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养；Neurobasal是神经细胞维持生长和成熟的基础培养基；此培养基配方中，DMEM/F12和Neurobasal以1:1混合配制。GlutaMAX是指谷氨酰胺，它是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必须氨基酸，本专利技术中作为细胞培养的必需添加物。Nicotinamide是指烟酰胺，为维生素B3，可促进神经发育，本专利技术中作为促进神经细胞生长的添加物。Transferrin(转铁蛋白)、Insulin(胰岛素)、Progesterone(孕酮)、Putrescine(腐胺)和Selenite(亚硒酸盐)在此培养基中作为补充剂，是维持神经细胞生长的添加剂。
[0018]优选的，所述S1包括：
[0019]S11：将人多能干细胞接种于人多能干细胞维持培养基中得到细胞悬液，所述人多能干细胞维持培养基中添加有Rock抑制剂；
[0020]S12：将细胞悬液悬浮培养得到拟胚体。
[0021]更优选的，将细胞悬液置于摇床上进行培养得到拟胚体。
[0022]其中，ROCK抑制剂即抑制Rho激酶(ROCK)功能的物质。例如包括Y
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27632、HA100、HA1152和Blebbistatin。Blebbistatin是一种细胞通透性的非肌肉肌球蛋白II型ATP酶抑制剂。
[0023]在本专利技术的一优选实施例中ROCK抑制剂为Y
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27632。培养基中Y
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27632的浓度只要是抑制Rho激酶的浓度即可为，例如浓度为1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、30μM、50μM，但不限于此。Y
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27632的优选浓度为10μM
[0024]更优选的，在S1之前还包括步骤S0，即培养人多能干细胞，在人多能干细胞的汇合
度为70
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90％时消化收集进行拟胚体形成实验。
[0025]更优选的，摇床的转速为10
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100rpm，培养时间为8
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32个小时，培养结束时，获得大小和形态较为均一的拟胚体。
[0026]优选的，所述S2包括：
[0027]S21：收集S1得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用无血清方法制备中脑多巴胺能神经前体细胞的方法，其特征在于，由以下步骤组成：S1：在D
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D0，将人诱导多能干细胞消化为单细胞悬液，重悬于人诱导多能干细胞维持培养基中得到细胞悬液，将细胞悬液3D培养形成拟胚体，所述人诱导多能干细胞维持培养基中添加有Rock抑制剂Y
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27632；S2：在D0
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D9，将S1得到的拟胚体在第一分化培养基中进行悬浮培养得到中脑底板细胞；所述第一分化培养基为神经特异性分化培养基，并添加有BMP4抑制剂、TGF
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β抑制剂、SHH激动剂和GSK3β抑制剂CHIR99021；S3：在D9
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D11，将S2得到的中脑底板细胞用3D的方法接种在第二分化培养基中进行分化培养得到中脑多巴胺能神经前体细胞；所述第二分化培养基为神经特异性分化培养基，并添加有BMP4抑制剂Noggin、GSK3β...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：