一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用，所述多能干细胞包含有Runx1和Hoxa9串联共表达载体。本发明专利技术将外源Runx1和Hoxa9共表达载体引入多能干细胞中，成功构建了诱导性共表达外源Runx1和Hoxa9的多能干细胞，所述多能干细胞定向分化为T谱系祖细胞，并将发育为T细胞。使用本发明专利技术的方法获得的多能干细胞来源的T细胞，不仅功能正常，而且没有致瘤风险。

【技术实现步骤摘要】
一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用
本专利技术属于医药生物工程
，涉及一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用。
技术介绍
多能干细胞(pluripotentstemcells，PSCs)是一类具有无限增殖潜能、分化形成不同谱系细胞组织、易于进行基因修饰的细胞，是当前干细胞研究的热点。诱导患者自体来源的多能干细胞分化形成不同的组织，不但可以规避伦理争议，而且降低了免疫排斥风险，是再生医学领域的应用热点。CAR-T作为一种新兴的免疫细胞疗法，具有特异性强、癌细胞清除效率高的特点，受到了广泛的关注。目前CAR-T疗法的免疫细胞主要来源于患者自身T细胞，然而一部分患者(例如婴儿、肿瘤晚期免疫缺陷病人和重度化疗病人)无法提供有效剂量的T细胞，且费用昂贵，极大地限制了该疗法的应用。通过多能干细胞获得功能性T细胞，可以解决上述问题。已有基础研究通过在人多能干细胞来源的生血内皮中表达转录因子ERG、HOXA5、HOXA9、HOXA10、LCOR、RUNX1和SPI1获得了具有多谱系造血重建能力的造血干组细胞(hematopoieticstemandprogenitorcells，HSPCs)，移植后可以产生多个造血谱系细胞(包括T细胞)(R.Sugimuraetal.Haematopoieticstemandprogenitorcellsfromhumanpluripotentstemcells.Nature,545,432-438(2017))，但上述研究需要使用多达七个转录因子进行干细胞诱导，操作复杂、稳定性差、效率较低。还有研究报道称，在内皮细胞中表达转录因子FOSB、GFI1、RUNX1和SPI1可以获得具有部分谱系造血重建能力(无T细胞谱系造血重建能力)的人造血多能祖细胞(hematopoieticmultipotentprogenitors)和具有全谱系造血重建能力的小鼠造血干细胞(hematopoieticstemcell)(V.M.Sandleretal.Reprogramminghumanendothelialcellstohaematopoieticcellsrequiresvascularinduction.Nature511,213-318(2014)；R.Lisetal.Conversionofadultendotheliumtoimmunocompetenthaematopoieticstemcells.Nature545,439-445(2017))，然而上述研究存在内皮细胞取材不便、基因编辑困难、技术方法繁琐、T谱系产生效率低等问题。因此，需要一种简单的诱导多能干细胞获得单一T谱系细胞的方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用，得到的多能干细胞来源的T细胞不仅功能正常，而且没有致瘤风险。第一方面，本专利技术提供了一种载体，所述载体包括Runx1和Hoxa9串联共表达。本专利技术中，将Runx1和Hoxa9的cDNA序列串联表达于同一载体，用于感染宿主细胞，可以得到稳定表达Runx1和Hoxa9的宿主细胞，操作简便、效率较高，得到的宿主细胞具有分化为T细胞的能力。第二方面，本专利技术提供了一种表达如第一方面所述载体的核酸。第三方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第一方面所述的载体；优选地，所述宿主细胞为多能干细胞。第四方面，本专利技术提供了一种多能干细胞定向分化T细胞的方法，包括以下步骤：(1)将Runx1和Hoxa9串联的表达载体整合到多能干细胞中，并进行抗性筛选；(2)将步骤(1)所述多能干细胞定向分化为造血干细胞前体细胞；(3)将步骤(2)所述造血干细胞前体细胞与小鼠骨髓基质细胞共培养，得到T谱系祖细胞；(4)诱导步骤(3)所述T谱系祖细胞分化为T细胞。本专利技术中，通过对Runx1和Hoxa9共表达的多能干细胞系进行定向分化，获得的造血干细胞前体细胞与OP9-DL1细胞系共培养获得T谱系祖细胞，分化后得到功能正常的T细胞，无致瘤风险。优选地，步骤(1)所述Runx1和Hoxa9串联的表达载体整合到多能干细胞的Rosa26位点。优选地，步骤(1)所述多能干细胞为基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系。优选地，步骤(1)所述整合的方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或至少两种的组合，优选为同源重组。优选地，步骤(1)所述抗性筛选采用潮霉素B。优选地，步骤(2)所述定向分化的方法为依次采用D0培养基、D2.5培养基、D3培养基、D4培养基、D5培养基、D6培养基和D7培养基培养多能干细胞得到所述造血干细胞前体细胞。优选地，所述D0培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4)的基础分化培养基，所述骨形态发生蛋白4的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL。优选地，所述D2.5培养基为含有3-8ng/mL激活素A(ActivinA)和3-8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的基础分化培养基，所述激活素A的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL。优选地，所述D3培养基为含有3-8ng/mL激活素A(ActivinA)、3-8ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4)和3-8ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)的基础分化培养基，所述激活素A的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL，所述骨形态发生蛋白4的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL，所述血管内皮生长因子的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL。优选地，所述D4培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4)和3-8ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)的基础分化培养基，所述骨形态发生蛋白4的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL，所述血管内皮生长因子的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL。优选地，所述D5培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4(BMP4)、3-8ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)、10-30ng/mL重组小鼠白介素3(mIL3)、10-30ng/mL重组小鼠白介素6(mIL6)、10-30ng/mL重组小鼠干细胞因子(mSCF)、10-30ng/mL重组人促血小板生成素(hTPO)和10-30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的基础分化培养基，所述骨形态发生蛋白4的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL，所述血管内皮生长因子的浓度例如可以是3ng/mL、5ng/mL或8ng/mL，优选为5ng/mL，所述重组小鼠白介素3的浓度例如可以是10ng/mL、20ng/mL或30ng/mL，优选为20ng/mL，所述重组小鼠白介素6的浓度例如可以是10ng/mL、20ng/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种载体，其特征在于，所述载体包括Runx1和Hoxa9串联共表达。

【技术特征摘要】
1.一种载体，其特征在于，所述载体包括Runx1和Hoxa9串联共表达。2.一种表达如权利要求1所述载体的核酸。3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求1所述的载体；优选地，所述宿主细胞为多能干细胞。4.一种采用如权利要求3所述的多能干细胞定向分化T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将Runx1和Hoxa9串联的表达载体整合到多能干细胞中，并进行抗性筛选；(2)将步骤(1)所述多能干细胞定向分化为造血干细胞前体细胞；(3)将步骤(2)所述造血干细胞前体细胞与小鼠骨髓基质细胞共培养，得到T谱系祖细胞；(4)诱导步骤(3)所述T谱系祖细胞分化为T细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述Runx1和Hoxa9串联的表达载体整合到多能干细胞的Rosa26位点；优选地，步骤(1)所述多能干细胞为基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系；优选地，步骤(1)所述整合的方法包括同源重组、CRISPR/Cas9、TALEN、转染或病毒感染中的任意一种或至少两种的组合，优选为同源重组；优选地，步骤(1)所述抗性筛选采用潮霉素B；优选地，步骤(2)所述定向分化的方法为依次采用D0培养基、D2.5培养基、D3培养基、D4培养基、D5培养基、D6培养基和D7培养基培养多能干细胞得到所述造血干细胞前体细胞；优选地，所述D0培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4的基础分化培养基，优选为含有5ng/mL骨形态发生蛋白4的基础分化培养基；优选地，所述D2.5培养基为含有3-8ng/mL激活素A和3-8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的基础分化培养基，优选为含有5ng/mL激活素A和5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的基础分化培养基；优选地，所述D3培养基为含有3-8ng/mL激活素A、3-8ng/mL骨形态发生蛋白4和3-8ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基，优选为含有5ng/mL激活素A、5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基；优选地，所述D4培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4和3-8ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基，优选为含有5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基；优选地，所述D5培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4、3-8ng/mL血管内皮生长因子、10-30ng/mL重组小鼠白介素3、10-30ng/mL重组小鼠白介素6、10-30ng/mL重组小鼠干细胞因子、10-30ng/mL重组人促血小板生成素和10-30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体的基础分化培养基，优选为含有5ng/mL骨形态发生蛋白4和5ng/mL血管内皮生长因子、20ng/mL重组小鼠白介素3、20ng/mL重组小鼠白介素6、20ng/mL重组小鼠干细胞因子、20ng/mL重组人促血小板生成素和20ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体的基础分化培养基；优选地，所述D6培养基为含有3-8ng/mL骨形态发生蛋白4、3-8ng/mL血管内皮生长因子、10-30ng/mL重组小鼠白介素3、10-30ng/mL重组小鼠白介素6、10-30ng/mL重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金勇，郭荣群，张梦云，刘丽娟，刘晓飞，吕翠，杜鹃，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44