一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。该检测引物组为：前外引物F3：5’‑CATACAGCTCTGCGTCTG‑3’；前内引物FIP：5’‑GCGG ATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA‑3’；后内引物BIP：5’‑GCCAAGGCCGTGTA GTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA‑3’；前环引物LF：5’‑CGGAATTGCAGACATTAC GC‑3’；后环引物LB：5’‑CTCTGCAGGTACTGGTAACC‑3’。本发明专利技术的检测引物组、检测试剂盒和检测方法具有特异性强，操作方便简单，检测时间短等优点，其反应过程不需要昂贵的仪器设备，反应结果可视化，直接通过肉眼观察即可判断，适合于现场快速检测的推广使用。

A ring mediated isothermal amplification detection primer group, detection method and detection kit for Vibrio Owen

The invention discloses a ring mediated isothermal amplification detection primer group, a detection method and a detection kit for Vibrio Owenii. The primer group was F3:5 'CATACAGCTCTGCGTCTG 3'; the pre primer FIP:5 'GCGG ATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA 3'; the posterior primer BIP:5 'GCCAAGGCCGTGTA GTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA 3'; the front ring primers LF:5 'CGGAATTGCAGACATTAC GC GC 3'; the rear ring primer LB. 5 'CTCTGCAGGTACTGGTAACC 3'. The detection primer group, detection kit and detection method have the advantages of strong specificity, easy operation, short detection time and so on. The reaction process does not need expensive instrument and equipment, the reaction result is visualized, and it can be judged directly by the naked eye. It is suitable for the popularization and use of fast detection in the field.

【技术实现步骤摘要】
一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒
：本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
：欧文氏弧菌(Vibrioowensii)是海洋中一种具有强毒力的肠道病原菌，可引发对虾急性肝胰腺坏死症，也可诱发锦绣龙虾在叶状幼体时期快速病变死亡，同时也是蔷薇珊瑚的致病菌，可感染珊瑚，导致珊瑚白化死亡。关于欧文氏弧菌致病以及如何检测防治的报导并不多见，早期对欧文氏弧菌的检测方法只是停留在一些比较传统的微生物分类鉴定以及传统的PCR检测技术。近期，关于欧文氏弧菌的检测方法有了新的进展，等温重组聚合酶扩增法，可以准确快速的检测出欧文氏弧菌，但此法需要用等温扩增荧光检测系统来检测和记录荧光信号的变化，而往往野外基层现场检测需要快速简便的方法，尽可能避免使用昂贵的仪器设备和繁琐的操作过程。环介导等温扩增(loop-mediatedisothemalamplification,LAMP)技术是2000年，Notomi等开发的一种恒温核酸扩增方法。其主要特点是，LAMP引物设计主要针对靶基因的6个不同区域，设计4条特异性引物，部分软件经过改进后可以设计6条特异性引物，从而加速了核酸在反应中的合成速度。DNA模板在链置换型DNA聚合酶(BstDNAPolymerase)的作用下，于65℃恒温扩增30-60min，便可合成大量核酸，具有操作简便、快速、特异性强、结果可肉眼判断等优点，具有很广阔的应用前景。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。本专利技术利用环介导等温扩增技术，以欧文氏弧菌的pryH基因(Genebank登录号为GU111253.1)为特异靶基因，设计、筛选并优化特异性引物，建立一种LAMP检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性对照组和阴性对照组，并通过钙黄绿素显色法和凝胶电泳分析检测样品组和其他两组对照的扩增产物来判断样品中是否含有欧文氏弧菌，以达到方便简单，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本专利技术的目的。本专利技术的第一个目的是提供欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，所述的检测引物组如下所示：前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’(如SEQIDNO.1所示)；后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’(如SEQIDNO.2所示)；前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’(如SEQIDNO.3所示)；后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’(如SEQIDNO.4所示)；前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’(如SEQIDNO.5所示)；后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’(如SEQIDNO.6所示)。本专利技术的第二个目的是提供欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、MnCl2溶液、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，所述的检测引物组如下所示：前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’(如SEQIDNO.1所示)；后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’(如SEQIDNO.2所示)；前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’(如SEQIDNO.3所示)；后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’(如SEQIDNO.4所示)；前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’(如SEQIDNO.5所示)；后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’(如SEQIDNO.6所示)。所述的阳性对照质控品优选为含欧文氏弧菌的pryH基因(Genebank登录号为GU111253.1)的质粒DNA，可以通过人工合成或从欧文氏弧菌的基因组DNA扩增得到。所述的阴性对照质控品优选为不含欧文氏弧菌的pryH基因的DNA或超纯水。所述的不含欧文氏弧菌的pryH基因的DNA可以为其他细菌的pryH基因或超纯水。如裂珊瑚弧菌(Vibriocoralliilyticus)；罗尼氏弧菌(Vibrioshilonii)；溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)；弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)；河流弧菌(Vibriofluvialis)；V.antiquarius；嗜气芽孢杆菌；荧光假单胞菌；金黄色葡萄球菌；超纯水。本专利技术的第三个目的是提供一种非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：(1)对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的基因组DNA作为模板；(2)使用上述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、MnCl2溶液、钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；(3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌。所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有欧文氏弧菌；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有欧文氏弧菌。所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有欧文氏弧菌具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有欧文氏弧菌；若无梯状条带，则样品中不含有欧文氏弧菌。优选，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括1×IsothermalAmpBuffer、6mmol/LMgSO4、1.4mmol/LdNTPMix、1.6μmol/LFIP、1.6μmol/LBIP、0.2μmol/LF3、0.2μmol/LB3、0.4μmol/LLF、0.4μmol/LLB、320U/mLBst2.0DNAPolymerase、1.2mol/L甜菜碱、1mmol/L氯化锰、1mmol/L钙黄绿素2μL和基因组DNA模板1μL，余量为去离子水。所述的环介导等温扩增反应的反应条件优选为：65℃反应60min，80℃终止反应10min。本专利技术根据欧文氏弧菌(Vibrioowensii)的管家基因pyrH设计特异性引物组，具有很好的特异性，可用于检测欧文氏弧菌。本专利技术设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该引物组的检测试剂盒和使用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定检测的样品中是否存在欧文氏弧菌。本专利技术的检测引物组，检测试剂盒和检测方法具特异性强，操作方便简单，检测时间短，无需昂贵的仪器设备等优点，特别适合野外基层的现场检测，具有广阔的应用前景。附图说明：图1是纯菌特异性实验中LAMP扩增产物的显色分析结果图；1.含欧文氏弧菌的pyrH基因的重组质粒；2.欧文氏弧菌(Vibri本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的检测引物组如下所示：前外引物F3：5’‑GCGTAGTAGGCGACCA‑3’；后外引物B3：5’‑CATACAGCTCTGCGTCTG‑3’；前内引物FIP：5’‑GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA‑3’；后内引物BIP：5’‑GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA‑3’；前环引物LF：5’‑CGGAATTGCAGACATTACGC‑3’；后环引物LB：5’‑CTCTGCAGGTACTGGTAACC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于：所述的检测引物组如下所示：前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’；后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’；前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’；后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’；前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’；后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’。2.一种欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、MnCl2溶液、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：前外引物F3：5’-GCGTAGTAGGCGACCA-3’；后外引物B3：5’-CATACAGCTCTGCGTCTG-3’；前内引物FIP：5’-GCGGATAGCGTCTGCCCACTTCACCGTGCTTATGTA-3’；后内引物BIP：5’-GCCAAGGCCGTGTAGTTATCTTGCTGCTGAATCTGTAGTGAA-3’；前环引物LF：5’-CGGAATTGCAGACATTACGC-3’；后环引物LB：5’-CTCTGCAGGTACTGGTAACC-3’。3.根据权利要求2所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含欧文氏弧菌的pryH基因的质粒DNA。4.根据权利要求2所述的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照质控品为不含欧文氏弧菌的pryH基因的DNA或超纯水。5.一种非疾病诊断和治疗目的的欧文氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈偿，杨艺滢，丁雄祺，谢媚，李红梅，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44