一种新型金属离子耐受性角蛋白酶及其应用制造技术

本发明专利技术为一种新型金属离子耐受性角蛋白酶及其应用，提供了一种基于宏基因组技术挖掘的角蛋白酶及其应用方法，属于工业生物技术领域。该角蛋白酶基因全长1,149bp，编码382个氨基酸；以枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600为例，成功实现了该角蛋白酶基因的异源表达。该角蛋白酶基因的获取方法方便可行，将该基因进行重组表达，构建的重组菌株可以实现重组角蛋白酶的分泌表达，重组角蛋白酶对金属离子和表面活性剂表现出较好的耐受性，酶稳定性较好。重组菌发酵周期短，适合于工业化大规模的生产。另外，该酶具有良好的还原能力，能应用于生物法制备纳米银粒子的研究中，制备得到的纳米银粒子具有良好的形态，并且具有较好的抑菌活性。

【技术实现步骤摘要】
一种新型金属离子耐受性角蛋白酶及其应用
本专利技术提供了一种新型金属离子耐受性角蛋白酶的基因挖掘、表达、性质研究及其在生物法合成纳米银中的应用方法，属于工业生物

技术介绍
角蛋白酶是能够特异性降解羽毛、羊毛、毛发、指甲等富含角蛋白的特殊的蛋白酶类。其能够降解不溶性的角蛋白而区别于一般的蛋白酶的特性使角蛋白酶能够广泛地运用于畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中。我国早期对微生物角蛋白酶的研究主要集中在角蛋白酶产生菌的选育、角蛋白酶的分离纯化和性质研究、角蛋白酶的应用上。2003年，吉林大学的梁斌等人首次成功将来自于地衣芽孢杆菌L-25的角蛋白酶基因进行了分离并且成功在枯草芽孢杆菌中实现了外源表达，自此，角蛋白酶的基因分离表达等分子生物学和基因工程研究开始受到越来越多国内研究者的关注。近几年来，不同来源的角蛋白酶在芽孢杆菌、大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母表达系统中重组角蛋白酶的表达上均取得了一定成功，但是表达水平以及重组角蛋白酶的降解活性并不理想，难以大量用于工业发酵，这也限制了角蛋白酶的工业应用。角蛋白酶早期主要运用于角蛋白废弃物的处理、皮革脱毛、饲料生产、洗涤剂中，近几年来，研究者将目标转向了角蛋白酶应用于管道毛发废弃物的清理，皮肤、指甲相关的药物，个人洗护用品等领域中。印度的一个科研团队从BacillushaloduransPPKS-2野生菌中纯化获得两个角蛋白酶，发现其中一个具有很高的二硫键还原活性(AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2010,87,2:625–633)；表明角蛋白酶具有良好的还原能力。近年来，随着纳米银制备技术的不断发展，纳米银的应用越来越广泛。银纳米材料具有特殊的物化性质，被广泛用于工业、医药等重要领域。在工业生产中，纳米银与银相比具有更好的催化活力，且加入纳米银后可有效改善产品的光学、热学、磁学等特性。在医药领域，纳米银常作为药物用于疾病的预防和治疗。纳米银粒子的制备方法有物理法、化学法和生物法。物理法包括真空沉积法、球磨法、蒸发冷凝法、等离子法等方法来制备，适用于大规模制备但是对设备要求较高，反应能耗高，产率低。化学法通过化学还原试剂将溶液中的银离子还原为单质银，然后聚集变为纳米级别的银粒子，反应中经常需要引入其它添加剂，如分散剂，稳定剂、保护剂等。这些添加剂中不乏毒性较大、污染严重的有机溶剂，因而不利于所制纳米银的广泛应用，尤其限制了其在医药领域中的应用(CN106180753A)。而生物法合成纳米银，主要通过生物样品中的酶类、蛋白质等物质还原出单质银，并且自身可以作为稳定剂制备得到纳米银粒子，因其方法简单易行、绿色环保、反应条件温和、低成本，以及制备得到的纳米粒子具有良好的生物相容性而受到国内外诸多研究者的关注。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型高金属离子耐受性角蛋白酶的基因挖掘、表达、性质研究及其生物法合成纳米银的应用方法，属于工业生物
提供包含本专利技术基因的质粒及包含该表达质粒的宿主细胞，利用该重组菌株表达生产角蛋白酶的方法，以及利用该角蛋白酶生物法合成纳米银的应用方法。本专利技术的技术方案是：基于宏基因组技术，以皮革厂堆放皮毛的土壤宏基因组DNA为模板，以角蛋白酶的保守序列进行简并引物设计并且进行PCR扩增，筛选目的角蛋白酶基因，然后根据测序结果进一步设计引物通过PCR技术扩增获得完整的基因编码序列。将获得的完整编码序列构建到表达载体上，例如枯草-大肠穿梭质粒pMA5，pET系列载体，pPIC系列载体等。将构建好的重组质粒转化至宿主菌枯草芽孢杆菌感受态细胞中、但不局限于枯草芽孢杆菌，还包括大肠杆菌，丝状真菌，谷氨酸棒杆菌，钝齿棒杆菌，毕赤酵母，酿酒酵母等，经发酵培养后实现角蛋白酶的异源表达。对该角蛋白酶进行酶学性质分析，利用其高金属离子耐受性及高还原能力的特性应用于生物法合成纳米银的制备，并对制备得到的纳米银进行多方面的表征和抑菌活性验证。(1)宏基因组技术筛选角蛋白酶基因从皮革厂堆放皮毛的地方收集土样，用土壤基因组提取试剂盒提取样品总DNA。根据角蛋白酶的保守序列设计简并引物进行PCR扩增反应，扩增获得的片段测序后与NCBI数据库进行比对，根据结果再进一步设计引物，扩增获得完整的角蛋白酶基因编码序列。该方法基于宏基因组技术，结合数据库中角蛋白酶的保守序列进行直接扩增筛选，与基于宏基因组文库构建筛选方法相比，具有操作方法简单易行，筛选周期短等优点。(2)角蛋白酶枯草芽孢杆菌表达体系的建立根据角蛋白酶基因序列设计带有酶切位点的引物，通过PCR扩增获得角蛋白酶编码基因序列：上游引物：5’-CGGGATCCATGAGAGGCAAAAAGGTATGG-3’下游引物：5’-CGACGCGTTTACTGAGCTGCCGCCTGTA-3’PCR扩增反应在40μL体系中进行，反应体系中加入20μLPrimeSTARHS，17μLddH2O，1μL模板DNA，上下游引物各1μL。反应条件为在95℃预变性5min后开始循环：95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化，回收产物克隆至载体构建重组质粒，将质粒转化至克隆宿主，挑取多个阳性转化子至带有相应抗生素的LB液体培养基中以37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后对质粒进行PCR、双酶切、测序验证。将正确验证的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌表达宿主菌中，并且涂布带有相应抗生素的固体培养基，用PCR验证的方法进一步筛选阳性转化子。将成功构建的角蛋白酶产生菌在固体培养基上划线分离出单菌落，然后挑取至10mL液体LB培养基中过夜培养，次日以2％的接种量接种至30mLTB发酵培养基中，进行角蛋白酶产酶研究。(3)重组角蛋白酶酶活检测方法1％角蛋白底物的配制：首先配制0.1MTris-HCl(pH＝9.0)的溶液，然后加入5％的可溶性角蛋白母液，再加入去离子水使Tris-HCl溶液浓度稀释为0.05M，并且使角蛋白溶液浓度稀释为1％。酶反应：取适度稀释的酶液100μL，加入0.1mL底物溶液，置50℃水浴准确反应15min，反应结束后立即加入200μL5％的TCA终止反应。对照组中先加入200μLTCA，酶反应结束后再加入0.1mL底物溶液。上述反应后以12000rpm离心5min，吸取200μL上清到新的1.5mL的EP管中，加入1mL0.4M的Na2CO3，再加入200μL福林酚，置40℃水浴显色反应20min后在680nm处检测吸光度值。酶活定义：在上述反应条件下，酶液水解底物在680nm下产生0.01的吸光度的差别定义为一个酶活单位U。酶活计算公式：U＝(OD680实验组-OD680对照组)×100×稀释倍数(4)重组角蛋白酶的酶学性质研究将重组角蛋白酶进行酶学性质研究，重点研究其对化学试剂以及金属离子耐受性的性质：A.金属离子对重组角蛋白酶酶活的影响在酶活测定反应体系中分别添加不同金属离子(Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Cd2+、Ba2+、Li+、Fe3+、Al3+、Pb2+、Ag+)，使其终浓度分别达到1mM和5mM，分别测定酶活力，以未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码角蛋白酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种编码角蛋白酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种编码角蛋白酶的基因，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种用于携带角蛋白酶编码基因的载体，其特征在于：含有权利要求1的核苷酸序列，所选择的载体包括pMA5质粒，pET系列，pPICZ系列，pDXW系列。4.一种用于生产角蛋白酶的重组菌株的制备方法，其特征在于：将权利要求3中的质粒导入外源宿主中，所述外源宿主包括大肠杆菌Escher...

【专利技术属性】
技术研发人员：史劲松，龚劲松，陶丽妍，许正宏，李恒，苏畅，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32