利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用制造技术

本发明专利技术属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用。本发明专利技术运用分子生物学技术，将分子伴侣DnaK与中性蛋白酶基因进行整合，构建了pHT43‑npr‑DnaK重组质粒，最后转化到宿主菌枯草芽孢杆菌WB800N中，构建了一株新的枯草芽孢杆菌工程菌株CGMCC No.14836，使分子伴侣DnaK与中性蛋白酶基因共表达，有效提高了中性蛋白酶的表达水平。

The preparation and application of neutral protease gene, protein, Bacillus subtilis and Bacillus subtilis using molecular chaperone DnaK

The invention belongs to the preparation of new gene and the construction of engineering bacteria, in particular to a neutral protease gene, protein and Bacillus subtilis constructed by molecular chaperone DnaK, and its preparation and application. The present invention using molecular biology techniques, the molecular chaperone DnaK and neutral protease gene were integrated to construct the pHT43 NPR DnaK recombinant plasmid, and finally transformed into the host bacteria Bacillus subtilis WB800N, constructed a new strain of Bacillus subtilis strain CGMCC engineering No.14836, the molecular chaperone DnaK and neutral protease gene co expression and effectively improve the expression level of neutral protease.

【技术实现步骤摘要】
利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用
本专利技术属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用。
技术介绍
传统的制革工艺会产生大量污染，制革排放的特色四废分别是：废水、污泥、废气和固体废弃物。其中各类污染的排放以水场部分的传统灰碱法脱毛环节为甚，灰碱毁毛脱毛法脱毛效果虽好，但被溶解的毛被、表皮与灰碱等污染物占制革废水总污染物的40％。近年来研究的清洁脱毛工艺主要有酶法脱毛、灰碱法基础上的保毛脱毛、有机胺脱毛、过氧化氢氧化脱毛和其他脱毛方法。中性蛋白酶(Neutralprotease)是在中性pH条件下作用于蛋白质肽键的酶类，能将蛋白质水解成氨基酸、多肽以及游离氨基酸，可广泛用于动植物蛋白水解，皮革脱毛、软化，羊毛丝绸脱胶等。蛋白酶法脱毛制革因脱毛条件温和，对真皮中角蛋白水解少，且毛从表皮分离回收，是目前为止最有可能代替灰碱法实现清洁脱毛工业化的方法。1398、2709蛋白酶制剂在20世纪初期曾作为脱毛酶应用在制革工艺中，但因其酶系中含有水解皮胶原的胶原蛋白酶，在大规模应用中如工艺控制不严会造成松面、烂皮现象；而纯化去除胶原蛋白酶所增加的工艺成本超出了制革厂的负荷，进而限制了蛋白酶制剂在皮革工业中的应用。有研究表明枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisS14、BacillussubtilisP13)及沙福芽孢杆菌(BacillussafensisLAU13)等菌株发酵生产的角蛋白酶对胶原蛋白水解能力相对较差，但在脱毛工艺中仍需要严格控制酶用量及脱毛时间，否则依旧会影响成革质量。因此，亟需研制一种理想的脱毛用酶产品，实现制革行业的“节能减排”、“低碳经济”，以促进制革业转型期保持稳定发展。为了高效表达中性蛋白酶基因，科研工作者做了很多试验。《枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达》(《基因组学与应用生物学》；2017年03期P906-910)中通过构建大肠杆菌原核表达载体pET30b-nprE，转化大肠杆菌BL21中得到重组工程菌，初步发酵酶活为39U/mL；《枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达》(《云南师范大学学报》；第25卷第3期P51-P56；2005年5月)中将编码枯草芽孢杆菌AS1.398的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中，电转化His4缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168，通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子，最后获得发酵酶活为20000U/mL的重组菌株。然而上述方法均存在弊端，转化到大肠杆菌中容易有包涵体的形成，且需要破壁来获得酶，这些不但会降低酶活而且限制了酶的分泌表达；转化到毕赤酵母中需要甲醇来诱导产酶，然而甲醇极易蒸发、难以检测浓度、反复添加不但操作麻烦，而且容易发生污染、另外在大量甲醇存在下会形成火灾隐患，且不宜于食品等蛋白生产。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白质较理想的宿主。它是一种安全的表达系统，其安全程度可以达到食品级，这是一般原核表达系统无法比拟的；具有很强的蛋白质分泌功能，蛋白质在细胞内合成后，可以通过特定机制(分泌途径)输出到细胞外培养基中。提取不需要破碎细胞，仅需较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质；没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体；发酵条件简单，产物易于分离纯化。分子伴侣(molecularchaperones)是细胞中一大类蛋白质，是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。研究表明，分子伴侣能够帮助蛋白正确折叠，提高蛋白的可溶性表达，减少包涵体的形成。Pfeffer等在E.coli表达目的蛋白的同时表达分子伴侣蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表达比例；张海军等在原核表达体系中加入HG-PGR07分子伴侣质粒与重组质粒pET-32-pfu共表达，使HG-PGR07表达的分子伴侣蛋白能够有效促进Pfu酶的可溶性表达和酶活性提高；万娟等的研究表明，pET-28a-med-ORF8与分子伴侣质粒pTf16共表达后，有效减少了包涵体的形成，提高了可溶性表达量。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因。本专利技术的目的之二在于提供一种利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供一种利用中性蛋白酶基因编码的蛋白。本专利技术的目的之四在于提供一种利用中性蛋白酶基因转化的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCGMCCNo.14836。本专利技术的目的之五在于提供一种枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis在制备中性蛋白酶中的应用。本专利技术的整体技术构思是：利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因，其基因序列为SEQIDNo.1。利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：A、克隆分子伴侣基因DnaK以解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CGMCCNo.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行PCR反应，上游引物DnaK-F：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcagtgagtaaagttatcggaat-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；下游引物DnaK-R：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；PCR反应体系为20μL：DNAmix10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，DMSO0.8μL，灭菌水8.2μL；PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳；B、PCR产物回收及纯化采用NEB公司DNAGelExtractionKit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照步骤A中的方法中进行电泳，然后切胶；C、中性蛋白酶基因的克隆C1、质粒酶切和新重组质粒的构建对pHT43-npr质粒进行BamHI和SmaI双酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和DnaK片段为模板，设计特定引物进行PCR反应，得到npr+DnaK片段；最后采用Gibson连接方法将pHT43片段和npr+DnaK片段进行连接，得到新的重组质粒；pHT43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N/pHT43-nprCGMCCNo.11625；上游引物npr-DnaK-F：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为BamHI酶切位点；下游引物npr-DnaK-R:5'-ctcattaggcgggc本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因，其特征在于其基因序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因，其特征在于其基因序列为SEQIDNo.1。2.利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：A、克隆分子伴侣基因DnaK以解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CGMCCNo.1.398基因组为模版，根据已知的解淀粉芽孢杆菌来源的中性蛋白酶编码区序列设计一对上下游引物进行PCR反应，上游引物DnaK-F：5'-gctgttggattgtaacccgggaaaggaggaaggatcagtgagtaaagttatcggaat-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；下游引物DnaK-R：5'-cattaggcgggctgccccgggttatttagaactgcttgaag-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；PCR反应体系为20μL：DNAmix10μL，浓度为10ng/μL的上、下游引物各0.4μl，浓度为10ng/μL的解淀粉芽孢杆菌基因组模版0.2μl，DMSO0.8μL，灭菌水8.2μL；PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变形30s，50℃退火1min，72℃延伸10min，循环20次，72℃再延伸20min，4℃保存；反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖电泳；B、PCR产物回收及纯化采用NEB公司DNAGelExtractionKit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按照步骤A中的方法中进行电泳，然后切胶；C、中性蛋白酶基因的克隆C1、质粒酶切和新重组质粒的构建对pHT43-npr质粒进行BamHI和SmaI双酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和DnaK片段为模板，设计特定引物进行PCR反应，得到npr+DnaK片段；最后采用Gibson连接方法将pHT43片段和npr+DnaK片段进行连接，得到新的重组质粒；pHT43-npr质粒来源于枯草芽孢杆菌BacillussubtilisWB800N/pHT43-nprCGMCCNo.11625；上游引物npr-DnaK-F：5'-ttacaaaaacatcagccgtaggatcccatcagcttaaagaaaacctgac-3'，其中下划线为BamHI酶切位点；下游引物npr-DnaK-R:5'-ctcattaggcgggctgccccgggttattttttgttttggtcgtc-3'，其中下划线为SmaI酶切位点；C2、大肠杆菌T1转化；C3、菌液PCR初步鉴定；C4、重组质粒DNA测序及检验实验的正确性。3.根据权利要求2所述的利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因的制备方法，其特征在于所述的步骤B中反应步骤及条件为：B1、将步骤A制备的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的BindingBuffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化；B2、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心lmin；B3、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体；B4、向吸附柱中加入700μLSPWWashBuffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次；B5、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min；B6...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨何宝，胡美荣，郑翔，高沛汝，牟庆璇，秦艳梅，陶勇，马清河，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13