第213位点发生突变的ACE突变基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新的人ACE突变基因形式，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，经验证它是人慢性阻塞性肺疾病即COPD的致病基因，所发生的突变为c.213T>A，这可以为COPD致病机理的解析和致病基因检测提供依据。此外，本发明专利技术还提供了基于Sanger测序的ACE突变基因检测方法，其中ACE突变基因片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，所构建的检测方法可以快速准确经济地获取COPD致病基因突变信息，有助于COPD的辅助分析。

Mutation of ACE gene in 213rd loci and its application

【技术实现步骤摘要】
第213位点发生突变的ACE突变基因及其应用
本专利技术涉及分子生物学和医学领域，具体涉及一种ACE突变基因及其在人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测中的应用。
技术介绍
人慢性阻塞性肺疾病(ChronicObstructivePulmonaryDisease，COPD)是一种具有气流受限特征的慢性气道疾病，其气流受限不完全可逆，常呈进行性发展,主要包括肺气肿、慢性支气管炎和末梢气道疾病。它是威胁人们健康的常见疾病，在所有疾病的死亡原因中高居第四位，且发病率和死亡率有逐年渐增的趋势，据WHO报导到2030年COPD或将成为世界第三大致死疾病，因此COPD的防治显得尤为迫切，而这离不开对其致病因素的深入解析。流行病学研究表明，COPD是由易感基因和环境因素共同作用所导致的疾病，其发病机制复杂，已知若干基因变异和多态性以及多种环境因素均是其致病的高危因素。到目前为止为研究所明确的是，a1-AT基因是当前唯一得到确认的与COPD发病有密切相关的基因，其编码的蛋白a1-抗胰蛋白酶（AAT)缺乏易发生C0PD；吸烟则是C0PD致病的最危险环境因素。然而a1-抗胰蛋白酶缺乏者仅占COPD的1%-2%，吸烟者中只有10%-15%会发生COPD，非吸烟者也可以发生慢性气流受限。除a1-AT基因之外，初步研究显示基质金属蛋白酶(MMPs)基因、SERPINA3基因、HMOX1基因、GST-S基因和ACE基因等少数几个基因的相关变异或多态性也和COPD易感性相关，但需要进一步确证。对于不同人种和人群，其COPD致病的遗传易感性位点既有共同部分也会有差异部分。目前中国人群特异的COPD易感或致病基因及其位点尚未得到很好揭示。本专利技术针对收集到的福建省及其周边地区的16个COPD特定家系，通过对相关家系成员进行人类基因组全外显子组测序分析比对，发现了COPD的一个新的遗传性致病基因突变——ACE基因的c.213T>A突变，并通过构建的Sanger测序检测法在人群样本中做了进一步的验证。ACE（AngiotensinConvertingEnzyme）是血管紧张素转化酶编码基因，携带ACE基因特定基因型的长期吸烟者，其体内的ACE活性明显增加，使血管紧张素II量增加，可以诱发气道炎症反应，从而促进COPD的发生。然而本专利技术提供的ACE致病基因突变并未见报道且与COPD患者吸烟与否并无直接关联，C0PD相关致病基因突变的全面系统解析将有助于其防治工作的开展。
技术实现思路
本专利技术提供了一种人ACE突变基因，其为慢性阻塞性肺疾病的致病基因。同时提供了基于Sanger测序技术的ACE突变基因检测方法；这些可以为特定ACE突变基因引起的COPD致病机理的解析和致病基因检测提供依据。本专利技术的目的之一在于提供一种人ACE突变基因，其序列分别如SEQIDNO.1所示，对应的突变为c.213T>A突变；发生c.213T>A突变的ACE基因经检测和验证为人类COPD致病基因，可以被应用于构建人类COPD致病基因检测方法和人类COPD致病基因检测试剂盒中。其中，参照野生型ACE基因序列（NCBI登录号为NG_011648.1），所述c.213T>A突变是指ACE基因第213位点的T核苷酸突变成了A核苷酸，SEQIDNO.1只展现ACE突变基因前500个核苷酸序列，其余序列详见参考序列NG_011648.1。本专利技术的另一目的在于提供特定ACE突变基因检测方法，该方法包括如下主要步骤：（1）ACE基因突变片段扩增提取待测者样本的基因组DNA，利用设计合成的PCR引物对进行ACE基因突变片段扩增；（2）ACE基因扩增片段测序分析将（1）中扩增的ACE基因突变片段进行Sanger测序，与野生型参考序列进行比对获取突变信息，以此应用于COPD辅助分析中。其中，步骤（1）中所述的样本为人体正常组织，优选血液或口腔粘膜；所述的PCR引物对其序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，53℃退火20s，72℃延伸40s，循环30次；72℃终延伸5min；所述的ACE基因突变是指ACE基因的c.213T>A突变。其中，步骤（2）中所述的Sanger测序只需按标准操作进行即可，也可以送样品到专业的DNA测序公司进行Sanger测序，最终需要得到ACE基因扩增片段的序列；所述COPD辅助分析包括COPD的辅助筛查和诊断。本专利技术提供的人ACE突变基因形式，可以为COPD致病机理的解析和致病基因检测提供依据；此外本专利技术提供的基于Sanger测序的ACE致病基因检测方法，可以快速准确经济地获取突变信息，有助于COPD的辅助分析。附图说明图1是实施例1中家系JX1相关信息，COPD先证患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示COPD患者，空心表示非COPD者；“+”表示存在ACE基因的c.213T>A突变，“-”表示不存在ACE基因的c.213T>A突变，“\”表示吸烟者；I、II分别代表第1和2代，数字为成员编号。图2是实施例1中家系JX2相关信息，COPD先证患者为图中II1。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；黑色填充表示COPD患者，空心表示非COPD者；“+”表示存在ACE基因的c.213T>A突变，“-”表示不存在ACE基因的c.213T>A突变，“\”表示吸烟者；I、II分别代表第1和2代，数字为成员编号。图3是ACE基因扩增片段电泳图谱，图中从左右到右对应DNAMarker和家系JX1成员II1、II2、II3、I1和I2样本。图4是COPD患者ACE基因扩增片段测序局部示意图谱，图中箭头指示第213位点测序结果为A核苷酸。图5是非COPD者其ACE基因扩增片段测序局部示意图谱，图中箭头指示第213位点测序结果为T核苷酸。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。COPD的发生涉及遗传因素和环境因素，这两者均发挥着重要的作用。吸烟是C0PD致病的最危险环境因素，然而在特定家系中，吸烟甚至是严重吸烟成员并不患COPD，而不吸烟成员反而患COPD，在此类家系中有很大可能性其遗传因素占主导地位。对于此类家系成员遗传差异性的解析，将是筛选COPD致病基因突变的良好切入点。COPD的相关检查和诊断分析遵循现有常规的临床实际和标准。肺功能是临床诊断的金标准：吸入支气管舒张剂后，FEV1/FVC<0.70，即为持续性气流受限。实施例1COPD致病基因筛选实施例1是16个COPD家系的全外显子组测序分析。（1）COPD家系入组和样本采集本研究选取无吸烟史且经临床确诊的COPD患者，通过询问其家系COPD发病情况，筛选其家系中兄弟姐妹有吸烟史却未患COPD成员的家系，对相关成员进行COPD相关检查确诊COPD患病情况并选择家系中COPD患者和非COPD健康成员进行全外显子组测序分析。前述事宜是在取得入选COPD家系相关成员知情同意情况下开展的。研究对象均来自福建省及其周边地区，共收集到16个符合条件的COPD家系。收集COPD患者的临床病理资料，采集所有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ACE突变基因，其特征在于ACE基因第213位点的T核苷酸突变成了A核苷酸即发生了c.213T>A突变，突变所在片段对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种ACE突变基因，其特征在于ACE基因第213位点的T核苷酸突变成了A核苷酸即发生了c.213T>A突变，突变所在片段对应的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的ACE突变基因在构建人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测方法和致病基因检测试剂盒中的应用。3.如权利要求2所述的人慢性阻塞性肺疾病致病基因检测方法,其特征在于检测靶标为ACE基因，主要步骤如下:（1）ACE基因片段扩增提取待测者样本的基因组DNA，利用设计合成的PCR引物对进行ACE基因突变片段扩增；（2）ACE基因扩增片段测序分析将（1）中扩增的ACE基因突变片段进行S...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈荷冰，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：陈荷冰，
类型：发明
国别省市：福建,35