一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，它是溶藻弧菌毒株的减毒活疫苗，其中缺失了溶藻弧菌毒株的sRNA分子伴侣蛋白基因hfq，溶藻弧菌毒株是溶藻弧菌毒株EPGS020401，保藏号为：CCTCC?NO：AB?209306，还提供了上述溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株的制剂，及相关的在防治养殖鱼类的溶藻弧菌病中应用，本发明专利技术的溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株或相关制剂消除了传统减毒活疫苗普遍存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类的溶藻弧菌病的一种安全、有效、经济的疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及减毒突变株
，特别涉及鱼用细菌性减毒活疫苗
，具体是指一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及应用。
技术介绍
随着世界人口的不断增长及人类对海产品需求的持续增强与天然渔业资源的日益枯竭这对矛盾的日益突出，水产养殖作为一种传统产业，在近代得到了快速，有效的发展，并在社会、经济和人们生活中突现出其重要地位。据统计，2002年我国水产品总量占全球总产量的71%和总产值的49. 8%，居世界第一位。据农业部统计，2009年我国的水产品总产量达5120万吨，同比增长4. 5%左右，其中，养殖水产品产量3635万吨。水产品总量连续20年位居世界第一位，连续7年成为世界第一水产品出口国。但是，由于水土资源的有限性，从提高养殖面积来增加产量难以实现持续发展。因此，规模化、集约化、高密度养殖模式已成为我国鱼类养殖业的主要发展方向。然而，伴随着渔业养殖的稳步发展，随之而来的便是各种水产养殖病害问题。在我国，近几年发展起来的海水网箱养殖和工厂化养殖鱼类的突发性、爆发性疾病频繁发生。目前，我国的海水养殖平均死亡损失率在30%以上，每年的经济损失多达160亿元，病害问题已成为制约海水养殖业健康发展的重要因素。为了防治各种病害的发生，以抗生素为代表的化学疗法曾发挥了积极作用。但是， 由于盲目投药，过量用药，不但污染了水质，增强了病原体的抗药性，提高了养殖成本，还直接危害到人类健康。在欧盟、美国和加拿大，以抗生素为主的化学药物在水产养殖业中已逐渐被禁用。其中，根据欧盟食品安全白皮书的规定，欧盟国家禁止使用抗生素药物的养殖水产品进入贸易市场。日本也开始限制使用多种抗生素药物用于养殖鱼类和虾类病害的防治。2002-2006年，我国水产品及制品出口保持了年均14. 8%的增速。但是自2007年以来，由于国内渔业生产成本上升、质量安全问题受到关注，以及日美欧等主要进口市场提高了进口的技术门槛，导致我水产品出口频频受阻。2008年中国水产品出口量为四6. 5万吨，同比下降3.2%，水产品出口量只占国内生产量6. 1%。一个主要的制约因素就是我国的水产品质量安全问题突出，药物和有害物残留超标严重，对中国水产品质量信用造成严重的负面影响，成为扩大出口的主要障碍。同时，由于病害严重，突发性强，为规避病害风险，生产者普遍提早收获，造成产品规格偏小，也影响了出口率和出口价格。为了增强水产养殖业的国际市场竞争力，扩大水产养殖的出口创汇，国家已提出并开始推广建立无公害养殖技术规范，其中一个主要技术指标就是禁止使用抗生素药物，以确保养殖水产品的食品质量安全。为了实现海水养殖业的可持续发展，遏制各种环境因素和养殖密度激增等造成的养殖鱼类病害日益严重的发展趋势，世界粮农组织结合发达国家渔业发展的成功经验 (Ormonde P.Fisheries resources :trends in production, utilization and trade.3In :Nomura I (ed.). The State of World Fishery and Agriculture2002. Rome :FA0 Information Division, 2002, p3 p45), fi ^ ^ f= S it (System management approaches, SMA)养殖模式预防各种病害的发生。这一措施中的一个主要内容就是提倡以疫苗接种为代表的各种免疫防治技术的应用。这些措施的采用将大大减少化学药物的使用，既避免了对环境的污染，又增加了水产品的消费安全性。作为符合环境友好、可持续发展战略的经济有效的疾病控制策略和手段，接种疫苗在现代水产养殖规范中正成为世界各国研究和开发的主要前沿和应用领域。目前，接种疫苗因其安全性，可靠性和持久性，已成为世界范围内防治水产养殖病害发生及暴发的主要手段。疫苗具有针对性强、抗病周期长、可终身免疫、效果显著和防治主动的特点。以病原菌细胞灭活体为基础形式的灭活疫苗(Kill vaccine)为水产养殖病害防治提供了有效手段，但灭活疫苗普遍具有给药不便(注射给药才具有较好的免疫保护力)的技术应用缺陷，对于需要免疫成千上万数量的鱼类养殖业来说极为不便，给药成本往往不能被水产养殖业所承受。而且，对于病害发生严重的鱼苗和幼鱼则无法实施注射给药，同时，对许多病害灭活疫苗往往效果不佳或无效。这一切都给水产养殖病害免疫防治技术的广泛应用带来了阻碍。水产养殖业的产业特点要求病害防治技术必须经济、应用实施方便。因此，疫苗产品的开发除高效价的技术要求外，免疫成本必须低廉，不能超出养殖业的承受能力。减毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的新技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。弧菌是引起海水养殖鱼类细菌性疾病危害的一种重要的病原体，可导致鱼类弧菌病(Vibriosis)，具有地域广，周期长，发生温度范围大等特点，且危害种类多，包括鲆类， 鲽类，鲈科等多种海洋鱼类。目前，我国海水养殖产业中危害比较严重的病原菌主要为溶藻弧菌(Vibrio algnolyticus)，鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。其中溶藻弧菌是我国南方水产养殖鱼类弧菌病爆发的主要病原体， 危害的鱼类主要有石斑鱼和大黄鱼等；而鳗弧菌则为北方水产养殖鱼类弧菌病的主要病原体，危害的鱼类包括牙鲆，大菱鲆，真鲷和鲈鱼等名贵经济鱼种。目前弧菌病在我国尚无有效的防治方法。溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处，并且数量位居海水类弧菌之首，也是我国南方海水养殖中鱼，虾，贝类等海水养殖动物弧菌病暴发的主要病原菌，导致被感染鱼体表发白，感染部位，尾部及鳍末端充血，发炎，严重时感染部位溃烂，并能引起内脏器官充血肿大，给水产养殖业带来巨大的经济损失。值得注意的是溶藻弧菌还会对人类带来威胁，可以引发创伤面感染，腹泻以及中耳炎等。目前对于溶藻弧菌的致病机理研究尚处于探索阶段，已鉴定的毒力相关因子包括胞外蛋白酶类、脂多糖、鞭毛和铁摄取相关系统等。目前国内用专利报道利用病原菌外膜蛋白及抗菌肽构建的亚单位疫苗对多种弧菌具有防治作用(吴灶和，庞欢瑛，姚绍云，简纪常，2007,海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备和使用方法；中国专利200610124342. X)。但由于亚单位疫苗不具有感染性，只能采取注射给药的方式进行免疫，而不能通过浸泡的方式给药，操作不便。且由于其只具有病原体的一种或几种抗原，而不含有病原体的其他抗原和遗传信息，仅利用单一的抗原分子诱导免疫反应，免疫效果不及活疫苗。此外，亚单位疫苗需要辅以佐剂，免疫剂量及成本相对较高，效果较差。基因无标记缺失减毒疫苗构建技术是目前国际上新兴起的活疫苗开发领域，是疫苗开发的国际前沿领域与主要发展方向之一，所开发的疫苗家具有可靠的产品和环境安全性。并且构建的减毒株具有表达异源抗原以开发多效价疫苗(特别是针对病毒病害)的潜在价值，也成为疫苗开发的国际前沿和热点领域。本专利技术涉及的溶藻弧菌野生毒株EPGS020401本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种溶藻弧菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，其特征在于，它是溶藻弧菌毒株的减毒活疫苗，其中缺失了所述溶藻弧菌毒株的ｓＲＮＡ分子伴侣蛋白基因ｈｆｑ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：王启要，刘欢，张元兴，刘琴，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31