【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和生物，特别是涉及一种还原糖氧化酶及其分泌表达菌株的构建和应用。
技术介绍
1、还原糖氧化酶可以将末端带有还原性糖残基的单糖和低聚糖氧化成相应的酸，产生过氧化氢，因此比葡萄糖氧化酶具有更加广泛的底物谱，将来会代替葡萄糖氧化酶应用在食品、饲料和动物保护等行业。同时，还原糖氧化酶还能氧化乳糖生产乳糖酸，氧化麦芽糖生产麦芽糖酸，可应用于各种糖酸的生产。elizabeth j团队最早从microdochiumnivale中发现还原糖氧化酶，此酶具有分泌肽，可以实现分泌表达。但在野生菌中还原糖氧化酶的表达产量低，酶活低且不易纯化。
2、毕赤酵母表达系统是目前商业化的真菌表达系统，具有操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低、可以对外源蛋白翻译后修饰等优点。因此将还原糖氧化酶基因导入到载体ppic9k中，并在毕赤酵母gs115中胞外表达得到重组还原糖氧化酶，可以进行快速的酶活鉴定和筛选工作。
3、里氏木霉(trichoderma reesei或hypocreajecorina)是一种嗜温腐生性的丝状真菌，在二战期间，被驻扎在所罗门群岛上的美军于腐烂的棉衣和帆布帐篷上发现。所分离到的菌株经鉴定为里氏木霉qm6a。从原始菌株qm6a出发，又经过一系列诱变育种，筛选出了一些纤维素酶高产菌株，如rut-c30。里氏木霉被广泛应用是因为其具有能自然分泌大量的内源蛋白到胞外的能力，且内源性纤维素酶经发酵其产量高达100g/l。里氏木霉因多样的翻译后修饰也让其成为表达同源和异源蛋白的常用宿主。里氏木
4、为了改善烘焙食品的品质，目前面粉中一般添加真菌α-淀粉酶。在加入真菌α-淀粉酶的情况下，一些破损淀粉颗粒被水解成麦芽糖(淀粉酶能内切直链淀粉成糊精，而糊精又在淀粉内切酶的作用下降解成麦芽糖)。麦芽糖又在酵母本身分泌的麦芽糖酶作用下，水解成葡萄糖供酵母利用，从而为酵母的发酵提供足够的糖源作为营养物质。在面包中添加真菌α-淀粉酶可以使面包变得柔软，能够增强面团的延展性以及持气的能力，麦芽糖能被酵母利用产生co2，从而使面包体积增大，糊精的存在使得面包纹理疏松，同时对改良面包外皮色泽有良好的效果，能在出炉后制成感觉良好的面包。
5、面粉中一般会加入葡萄糖氧化酶。在有氧参与的条件下，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成δ-d-葡萄糖内酯，同时产生过氧化氢。过氧化氢是一种很强的氧化剂，能够将面筋分子中的巯氢基(-sh)氧化为二硫键(-s-s-)，从而增强面筋的强度。还原糖和蛋白质在常温或者加热情况下，会发生缩合、聚合反应(美拉德反应)，生成类黑色素、芳香化合物等多种物质。过多的美拉德反应会导致烘焙食品颜色变深，白度降低。因此，葡萄糖氧化酶也能提高烘焙食品的白度。
6、葡萄糖氧化酶具有高度的专一性，它只对葡萄糖分子c1上的β-羟基起作用，无法氧化麦芽糖和糊精末端的β-羟基。本专利技术提供一种效果更佳的还原糖氧化酶，可以氧化葡萄糖、麦芽糖、麦芽糊精，能够显著减少氧化酶的用量，提高烘焙食品的白度，将更适合于实际的烘焙需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种还原糖氧化酶及其分泌表达菌株的构建和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供的还原糖氧化酶具有氧化葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精的功能，可以显著提高烘焙食品的白度和口感。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种还原糖氧化酶，其氨基酸序列如seq id no.1～12任一项所示。
4、本专利技术还提供一种上述的还原糖氧化酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.13～36任一项所示。
5、本专利技术还提供一种表达载体，包含上述的编码基因。
6、本专利技术还提供一种重组微生物菌株，包含上述的表达载体。
7、进一步地，所述重组微生物菌株包含重组毕赤酵母或重组里氏木霉；
8、所述重组毕赤酵母异源表达核苷酸序列如seq id no.13～24任一项所示的还原糖氧化酶；所述重组里氏木霉异源表达核苷酸序列如seq id no.25～36任一项所示的还原糖氧化酶。
9、本专利技术还提供一种生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉的构建方法，包括如下步骤：
10、合成还原糖氧化酶的编码基因，构建表达载体；
11、将所述表达载体转化至里氏木霉中，获得生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉。
12、进一步地，所述还原糖氧化酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.25～36任一项所示；所述表达载体包含里氏木霉纤维素酶编码基因的启动子序列、所述还原糖氧化酶的编码基因序列和里氏木霉纤维素酶编码基因的终止子序列。
13、本专利技术还提供一种上述的编码基因或上述的表达载体或上述的重组微生物菌株在生产还原糖氧化酶中的应用。
14、本专利技术还提供一种还原糖氧化酶的生产方法，包括将上述的重组微生物菌株发酵培养，收集发酵液的步骤。
15、本专利技术还提供一种上述生产方法获得的还原糖氧化酶在面制食品加工中的应用。
16、本专利技术公开了以下技术效果：
17、本专利技术公开了12个还原糖氧化酶的氨基酸序列，及其在毕赤酵母和里氏木霉中表达的工程菌株。本专利技术利用商业化的表达质粒ppic9k在毕赤酵母中胞外表达还原糖氧化酶，进行酶活力和耐热的筛选，并鉴定了这12个还原糖氧化酶具有氧化葡萄糖、乳糖、麦芽糖、麦芽糊精的功能；之后利用里氏木霉表达质粒分泌表达还原糖氧化酶，通过将还原糖氧化酶的编码基因转化到里氏木霉基因组中，依次代替里氏木霉中分泌表达量最高的两个纤维素酶基因——cbh1和cbh2，成功构建了分泌表达还原糖氧化酶的里氏木霉生产菌株。该生产菌株可用于食品级的还原糖氧化酶的生产，生产获得的还原糖氧化酶相较于同等酶活的葡萄糖氧化酶可以显著提高烘焙食品(如面包)的口感和白度。
18、可见，本专利技术经过对里氏木霉菌进行基因改造后，成功构建了分泌表达还原糖氧化酶的工程菌株，该工程菌株生产的还原糖氧化酶可以应用在食品行业，提高烘焙食品的品质。
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1.一种还原糖氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～12任一项所示。
2.一种如权利要求1所述的还原糖氧化酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～36任一项所示。
3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。
4.一种重组微生物菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组微生物菌株，其特征在于，所述重组微生物菌株包含重组毕赤酵母或重组里氏木霉；
6.一种生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述还原糖氧化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.25～36任一项所示；所述表达载体包含里氏木霉纤维素酶编码基因的启动子序列、所述还原糖氧化酶的编码基因序列和里氏木霉纤维素酶编码基因的终止子序列。
8.一种如权利要求1所述的编码基因或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的重组微生物菌株在生产还原糖氧化酶中的应用。<...
【技术特征摘要】
1.一种还原糖氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1～12任一项所示。
2.一种如权利要求1所述的还原糖氧化酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.13～36任一项所示。
3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。
4.一种重组微生物菌株，其特征在于，包含权利要求3所述的表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组微生物菌株，其特征在于，所述重组微生物菌株包含重组毕赤酵母或重组里氏木霉；
6.一种生产还原糖氧化酶的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，喻超，丛家玮，蔡万钏，陈雨蒙，杨姣，黄浩，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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