一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种红色红曲霉α‑淀粉酶基因、其制备方法及应用。该技术方案从红色红曲霉NRRL1597全基因组中筛选得到一种与米曲霉α‑淀粉酶A高度同源的淀粉酶蛋白表达基因，并围绕其序列特征设计了PCR扩增方法。在此基础上，本发明专利技术先以红色红曲霉CICC41233为实验菌株，PCR扩增得到目的基因，再以其构建双元质粒表达载体pNeo0380‑440333，而后通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，得到一株红曲色素高产菌株，该菌株可显著促进大米淀粉的降解，从而提高红曲色素产量。在此基础上，本发明专利技术围绕重组菌株的生物学特性设计了专用于生产红曲色素的发酵方法，所产红曲色素产量均显著高于野生型菌株，同时提升了红曲色素中醇溶性成分的比例。

A red Monascus alpha amylase gene, preparation method and application thereof

The invention provides a red Monascus alpha amylase gene, a preparation method and application thereof. In this scheme, an amylase protein expression gene homologous with Aspergillus oryzae alpha amylase A was screened from the whole genome of Aspergillus oryzae NRRL1597, and the PCR amplification method was designed around its sequence characteristics. On this basis, the present invention first used Aspergillus oryzae CICC41233 as the experimental strain, PCR amplified the target gene, and then constructed the dual plasmid expression vector pNeo0380 440333, and then transformed it into the parent red Aspergillus red by using the Agrobacterium tumefaciens EHA105 to get a high yield red yeast strain. It can promote the degradation of rice starch and increase the yield of Monascus pigment. On this basis, the invention designed the fermentation method specially for the production of Monascus pigment. The yield of Monascus pigment was significantly higher than that of the wild type, and the proportion of the alcohol soluble components in the red yeast pigment was increased.

【技术实现步骤摘要】
一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用
本专利技术涉及工业微生物
，进一步涉及基因工程技术以及霉菌的发酵技术，具体涉及一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用。
技术介绍
红曲色素是由微生物红曲霉菌(Monasusspp.)，以大米为原料发酵而成的天然色素，在我国有一千多年的历史。作为食品添加剂，红曲色素广泛应用于食品加工和化妆品制造等领域；因其还具有广泛的生物活性如调血脂、降血压、防血管硬化、抗糖尿病、抑制肥胖、抗炎症、抗过敏、防过氧化、抗癌、抗细菌、抗真菌等，它在益生保健产品开发和医疗领域的应用也越来越受到重视。红曲色素是红曲霉的次级代谢产物，由脂肪酸合成途径和聚酮合成途径共同完成合成代谢。其化学结构主要分为聚酮和脂肪酸链两部分。脂肪酸链的合成以乙酰CoA为前体，经脂肪酸合酶(Fattyacidsynthase，FAS)复合体作用，经过一系列合成反应形成中长链脂肪酸，其与乙酰CoA反应生成β-酮酸；聚酮的合成同样以乙酰CoA为前体，在聚酮合酶(Polyketidesynthase,PKS)作用下，依次合成多聚酮体化合物，最终形成带有生色基团的聚酮。聚酮的羧基基团与脂肪酸链的羟基基团发生酯化反应，从而形成红曲色素。基于以上原理，为了提高红曲色素的产量，现有技术普遍通过发酵工艺改良来实现红曲霉的代谢调控，进而定向累积目的产物；尽管发酵条件的优化能在一定程度上改善红曲色素产量，但受限于红曲霉自身的代谢特性，红曲色素累积很难再进一步提高。此外，红曲霉所产红曲色素分为醇溶性色素和水溶性色素。醇溶性色素为红曲霉在发酵过程中直接合成，存在于胞内；水溶性色素是红曲霉自身合成的色素与发酵液中氨基酸等物质结合形成的复合色素，分布于胞外。在天然菌株的生长过程中，这两种红曲色素均有产生，单纯凭借培养方法无法实现定向生产其中一种红曲色素。在这种情况下，通过基因工程技术构建具有特定发酵能力的工程菌，成为了提升红曲色素产量、改善醇溶成分比例的重要技术手段。现有技术研究表明，在红曲霉基因组中引入同源的淀粉酶表达基因，是一种可行的方法；然而其效果优劣极大的依赖于淀粉酶表达基因的性能。因此，根据亲本红曲霉的基因组及代谢特性找到一种淀粉酶高效表达基因，并围绕其性质确定菌株构建方法，成为了解决以上技术问题的关键。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用，以解决现有技术缺乏一种用于基因工程的、α-淀粉酶高效表达基因的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是如何以红色红曲霉菌株CICC41233出发，构建一种红曲色素产量更高的基因工程菌。本专利技术要解决的又以技术问题是如何以红色红曲霉菌株出发，构建一种醇溶性红曲色素产量更高的基因工程菌。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种红色红曲霉α-淀粉酶基因，该基因的DNA序列如SEQIDNO:1所示。以上基因可以是通过以下方法发现的。从红色红曲霉(Monascusruber)NRRL1597基因组数据库(https://genome.jgi.doe.gov/Monru1/Monru1.home.html)中查询预测有13种α-淀粉酶基因。依据米曲霉α-淀粉酶A基因的蛋白质(AOamyA，GenBankaccessionno.BAA00336.1)序列，构建系统进化树。其中蛋白质编号为P440333与AOamyA同源关系最近为79％。依据P440333的基因序列，设计引物。同时，本专利技术提供了克隆的红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。同时，本专利技术提供了上述红色红曲霉α-淀粉酶基因的制备方法，包括以下步骤：提取红色红曲霉菌株的总DNA作为模板，以序列为SEQIDNo:4、SEQIDNo:5的一对引物进行PCR扩增，扩增产物即为所述红色红曲霉α-淀粉酶基因。作为优选，该制备方法中所选用的红色红曲霉菌株为红色红曲霉CICC41233株。作为优选，将所制备的红色红曲霉α-淀粉酶基因连接到pMD19-T载体上，用于测序。此外，本专利技术还另外提取红色红曲霉CICC41233的总RNA，采用相应的引物进行RT-PCR扩增，得到直接编码该蛋白的mRNA的cDNA序列，将其连接到pMD19-T载体上，测序，序列如SEQIDNO:2所示应用上述红色红曲霉α-淀粉酶基因构建红曲色素高产菌株的方法，包括以下步骤：1)取所述红色红曲霉CICC41233α-淀粉酶基因和pNeo0380载体，用限制性内切核酸酶HindIII、SacI分别对二者进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，得到双元质粒表达载体pNeo0380-440333；2)用根癌农杆菌EHA105介导所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。作为优选，该构建方法中所选用受体红色红曲霉菌株为红色红曲霉CICC41233株。作为优选，步骤2)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。作为优选，所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取lmL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。作为优选，所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30min；液氮中速冻1min，37℃水浴3min，再冰浴2min；加入800μLYEP液体培养基，28℃培养3h；常温下以5000rpm的转速离心3min，浓缩菌体；取200μL浓缩后的菌液涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL卡那霉素的YEP选择性培养基平板上，28℃倒置培养2d；挑选转化子于YEP液体培养基中培养，并用引物对克隆子进行筛选，得到阳性克隆子，即为含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105。作为优选，所述将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，包括以下步骤：取红色红曲霉菌株，用MPS固体培养基培养7d，获取分生孢子，用无菌水悬浮孢子，振荡分散孢子，经2层擦镜纸过滤，调节孢子浓度；取含有双本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红色红曲霉α‑淀粉酶基因，其特征在于该基因的DNA序列如SEQ IDNO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种红色红曲霉α-淀粉酶基因，其特征在于该基因的DNA序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述红色红曲霉α-淀粉酶基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。3.一种权利要求1所述红色红曲霉α-淀粉酶基因的制备方法，其特征在于包括以下步骤：提取红色红曲霉菌株CICC41233的总DNA，以此作为模板，以序列为SEQIDNo:4、SEQIDNo:5的一对引物进行PCR扩增，扩增产物即为所述红色红曲霉α-淀粉酶基因。4.应用权利要求1所述红色红曲霉α-淀粉酶基因构建红曲色素高产菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：1)取所述红色红曲霉α-淀粉酶基因和pNeo0380载体，用限制性内切核酸酶HindIII、SacI分别对二者进行酶切，将酶切产物用T4DNA连接酶连接，得到双元质粒表达载体pNeo0380-440333；2)用根癌农杆菌EHA105介导所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333，转化至红色红曲霉菌株中，筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤2)具体包括以下操作：先制备感受态的根癌农杆菌EHA105，再通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，而后将含有双元质粒表达载体pNeo0380-440333的根癌农杆菌EHA105转化至红色红曲霉菌株中，再筛选阳性克隆，即得到所述红曲色素高产菌株。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述制备感受态的根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：将根癌农杆菌EHA105接种于5～10mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养24h；取lmL活化的菌液接种于20mL含有50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，以温度28℃、搅拌转速200rpm的条件培养至菌液OD600值0.5；将菌液冰浴30min后，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清；用0.15mmol/L的氯化钠溶液l0mL重悬沉淀，在4℃条件下以5000rpm的转速离心5min，弃上清，而后悬浮于20mmol/L的氯化钙溶液1mL中。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述通过液氮冻融法将所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333导入根癌农杆菌EHA105，包括以下步骤：取1μg所述双元质粒表达载体pNeo0380-440333加入到200μL感受态的根癌农杆菌EHA105中，混合后冰浴30...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙传南，曾斌，谢韶斌，张冬生，曾旭，谢坚，梁玉梅，刘梦梦，王杰，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36