一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其培养基技术

本发明专利技术涉及一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其专用培养基，包括脐带组织复苏、组织块获得、分离原代干细胞和扩增传代干细胞步骤，其中，使用消化液为含有的Ⅱ型胶原酶、TrypLE

A method for isolating and amplifying stem cells after umbilical cord tissue resuscitation and its culture medium

The invention relates to a method for separating and amplifying stem cells after the resuscitation of umbilical cord tissue and its specific medium, including the recovery of umbilical cord tissue, the acquisition of tissue blocks, the separation of the primary stem cells and the amplification of the generation of stem cells, in which the digestive juice is used as a type of type II collagenase and TrypLE

【技术实现步骤摘要】
一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其培养基
本专利技术属于细胞培养领域，特别涉及一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其专用培养基。
技术介绍
由于人脐带间充质干细胞hUCMSCs)具有自身独特的优点和特性，且含量丰富，取材容易，是目前研究较为广泛的人源干细胞，hUCMSCs的分离培养方式也日益便利和完善，常规的方法即为将取得的人脐带进行初步的处理，进行冻存，然后在需要时，将冻存的人期待进行干细胞分离与培养，通常原代干细胞主要是以酶消化法，或组织块法获得，酶消化法可以在短时间获得细胞，但是获得的细胞具有较多杂质，经多次传代才可以纯化，且消化时间难以掌控，对细胞的损害较大；而组织块法具有培养周期长，得到的细胞数量少，得到的原代干细胞传代能力差等缺点；如何获得大量稳定或利好的细胞是人脐带间充质干细胞培养的难点。另一方面，在细胞的体外培养过程中，大多数研究者仍然采用经典培养基加入胎牛血清进行干细胞培养，然而，异种血清存在这一定的安全隐患，对hUCMSCs的临床应用造成一定的局限。且扩增后细胞按照国际细胞治疗协会(ISCT)提出的最低标准进行了鉴定,即人脐带间充质干细胞必须满足三条才可以被认为是人脐带间充质干细胞。首先细胞必须是贴壁生长；其次人脐带间充质干细胞必须表达CD90、CD105、CD73等间充质细胞的特异性标记，而不表达造血系或内皮系细胞的标记：CD45，CD14，CD19，CD34及主要组织相容性抗原HLA-DR；再次必须具有分化为骨、软骨、脂肪细胞的多向分化潜能。
技术实现思路
本专利技术的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，具体技术方案如下：1)脐带组织复苏：取出冻存脐带组织的冻存管，放置于37℃水浴中解冻，解冻完毕后，采用复苏缓冲液洗涤3-5次，得到复苏后脐带组织；2)组织块获得；将步骤1)所得的复苏脐带组织切成1mm3组织块，加入消化液于15℃消化1-2h，然后在37℃消化5-10min,终止消化，移除消化液及悬浮细胞，获取未消化组织块，于氯化钠注射液中漂洗，离心弃上清，得剩余组织块；其中，所述消化液为含有0.5-0.7mg/ml的Ⅱ型胶原酶、0.1-0.2mg/ml的TrypLEexpress和0.3-0.5mg/ml脯氨酞氨基酸的氯化钠注射液；3)分离原代干细胞：将剩余组织块放置于培养皿中，相邻剩余组织块之间间隔15-20mm，将培养皿放置于37℃培养箱中静置10min,然后向培养皿中加入培养基，保证剩余组织块能完全浸润在培养基中；每天半数换液，培养2天后，将剩余组织块移入新培养皿，更换培养基，保证剩余组织块浸润却不悬浮，然后继续培养，待细胞融合至80-90％，收获原代干细胞；4)扩增传代干细胞：取步骤3)得到的原代干细胞，重悬于培养基中，按照4-5×104个/mL的浓度，在37.0±0.5℃的温度、5.0±0.2％的CO2浓度和饱和湿度的条件下进行传代培养。采用上述方法，人脐带间充质干细胞爬出时间短，原代干细胞培养周期短仅需要7-10天即得，且得到的原代干细胞纯度高，活性好，可进行多次传代，多次传代后得到的干细胞依然具有高度分化的潜能，且本专利技术所提供的分离培养方法非常稳定，重复成功率高；TrypLEexpress即TrypLETMexpress，为现有市售产品，例如可购自Invitrogen公司。进一步地，其中所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：10-15mg/ml硒酸钠、20-30μg/ml牛转铁蛋白、85-100μg/ml鸟氨酸、5-7mg/ml植物血凝素、12-18mg/mlα-生育酚琥珀酸单酯、35-40ng/mlIL-6、9-15μg/mlLIF和20-35μg/mlHGF。采用上述人脐带干细胞专用的无血清培养基，配合本专利技术所提供的人脐带干细胞培养方法，可以高效的得到高纯度、高数量的原代干细胞，细胞传代数量多，速度快。进一步地，步骤3)中，细胞培养的前2天，向培养基中添加16-22mg/ml亚油酸和5-8μg/ml腺苷脱氨酶，进一步提高了培养后原代干细胞的纯度。进一步地，向传代干细胞的培养基中加入10-20mg/ml无水硫酸钙、2-4mg/ml的NAC和100-200ng/mlPDGF-AB。在干细胞传代过程中，向培养基中适当添加营养成分，可以有效促进干细胞传代过程中的增殖能力，提高细胞耐受凋亡能力，在干细胞传至18代时，传代速度依旧较快，得到的传代干细胞依然具有优异的多向分化潜能。优选地，所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：12mg/ml硒酸钠、24μg/ml牛转铁蛋白、91μg/ml鸟氨酸、6mg/ml植物血凝素、16mg/mlα-生育酚琥珀酸单酯、37ng/mlIL-6、10μg/mlLIF和30μg/mlHGF。进一步地，所述复苏缓冲液为含有15mmol/L蔗糖和0.05％胰蛋白酶的PBS。进一步地，所述步骤3)的原代干细胞培养条件为：37℃、5％CO2、8％O2的潮湿空气，PH值保持7.2-7.4。上述培养条件的设置，有利于干细胞的增长，得到的干细胞数目多。进一步地，步骤3)中所述新培养皿表面包被鼠尾胶。更进一步地，所述培养皿包被鼠尾胶的方法为：采用1.2mg/ml的鼠尾胶去离子水溶液，均匀涂布于培养皿表面，放入37℃、5％CO2的培养箱中包被1h，吸弃溶液后加入无菌氯化钠注射液冲洗3遍，再加入DMEM/F12培养液冲洗两遍，吹干即得。将培养皿进行鼠尾胶包被，可以提高干细胞爬出时间与贴壁效率，进一步缩短培养时间，提高培养效率。本专利技术还提供一种用于脐带组织复苏后干细胞培养的培养基，所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：10-15mg/ml硒酸钠、20-30μg/ml牛转铁蛋白、85-100μg/ml鸟氨酸、5-7mg/ml植物血凝素、12-18mg/mlα-生育酚琥珀酸单酯、35-40ng/mlIL-6、9-15μg/mlLIF和20-35μg/mlHGF。本专利技术所提供的用于脐带组织复苏后干细胞培养的培养基，解决生物安全性问题，与传统含血清培养基相比，对人脐带间充质干细胞的体外培养增殖更为有利，得到人脐带间充质干细胞纯度高，活性好。本专利技术提供了一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，根据人脐带间充质干细胞的生长特性与需求，采用酶消化和组织块法相结合，进行原代干细胞的分离培养，极大程度缩短人脐带间充质干细胞的爬出时间，缩短培养周期，得到的原代干细胞纯度高，数量大，质量好，在传代过程中可以有效促进干细胞的增殖能力，提高细胞耐受凋亡能力，在干细胞传至18代时，传代速度依旧较快，得到的传代干细胞依然具有优异的多向分化潜能。附图说明图1.细胞生长直方图。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围；本专利技术中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本专利技术中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。实施例1一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1)脐带组织复苏：取出冻存脐带组织的冻存管，放置于37℃水浴中解冻，解冻完毕后，采用复苏缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)脐带组织复苏：取出冻存脐带组织的冻存管，放置于37℃水浴中解冻，解冻完毕后，采用复苏缓冲液洗涤3‑5次，得到复苏后脐带组织；2)组织块获得；将步骤1)所得的复苏脐带组织切成1mm

【技术特征摘要】
1.一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)脐带组织复苏：取出冻存脐带组织的冻存管，放置于37℃水浴中解冻，解冻完毕后，采用复苏缓冲液洗涤3-5次，得到复苏后脐带组织；2)组织块获得；将步骤1)所得的复苏脐带组织切成1mm3组织块，加入消化液于15℃消化1-2h，然后在37℃消化5-10min,终止消化，移除消化液及悬浮细胞，获取未消化组织块，于氯化钠注射液中漂洗，离心弃上清，得剩余组织块；其中，所述消化液为含有0.5-0.7mg/ml的Ⅱ型胶原酶、0.1-0.2mg/ml的TrypLEexpress和0.3-0.5mg/ml脯氨酞氨基酸的氯化钠注射液；3)分离原代干细胞：将剩余组织块放置于培养皿中，相邻剩余组织块之间间隔15-20mm，将培养皿放置于37℃培养箱中静置10min,然后向培养皿中加入培养基，保证剩余组织块能完全浸润在培养基中；每天半数换液，培养2天后，将剩余组织块移入新培养皿，更换培养基，然后继续培养至细胞融合80-90％，收获原代干细胞；4)扩增传代干细胞：取步骤3)得到的原代干细胞，重悬于培养基中，按照4-5×104个/mL的浓度，在37.0±0.5℃的温度、5.0±0.2％的CO2浓度和饱和湿度的条件下进行传代培养。2.如权利要求1所述脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，其中所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：10-15mg/ml硒酸钠、20-30μg/ml牛转铁蛋白、85-100μg/ml鸟氨酸、5-7mg/ml植物血凝素、12-18mg/mlα-生育酚琥珀酸单酯、35-40ng/mlIL-6、9-15μg/mlLIF和20-35μg/mlHGF。3.如权利要求2所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，步骤3)中，细胞培养的前2天，向培养基中添加16-22mg/ml亚油酸和5-8μg/ml腺苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹毓琳，刘俊江，时兆田，白志惠，
申请(专利权)人：吉林国健生命工程科学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22