一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种从月经血中快速高效分离宫内膜间充质干细胞的方法，所述方法为：收集月经血离心除去上层血浆，沉淀a中加入溶液Ⅰ，迅速混匀后，静置1～3分钟，而后加入溶液Ⅱ，混匀后离心，去上清液，获得的沉淀b用培养液悬浮，接种至细胞培养瓶中，48h后换液，除去未贴壁细胞，而后每2～3天换液，长至90％汇合时，消化传代，收集P3代细胞，即为纯化的EnMSCs。利用本发明专利技术方法所得EnMSCs在纯度方面与传统方法相比无差异，但本发明专利技术所述方法制备时间更短，分离过程耗时不超过15min，本方法所用分离试剂成分简单可控，操作方便，在降低制备成本的同时也提高了安全性。

A method of separating endometrial mesenchymal stem cells from menstrual blood

The present invention provides a method for rapid and efficient separation of endometrial mesenchymal stem cells from menstrual blood. The method is to collect menstrual blood by centrifugation to remove the upper plasma, precipitate a and add solution I, after mixing quickly, for 1~3 minutes, then adding solution II, centrifugation after mixing and removing the supernatant, and the precipitated B obtained. The culture liquid was suspended and inoculated into the cell culture bottle. After 48h, the liquid was changed, and the non adherent cells were removed and then changed every 2~3 days. When it was 90%, the cells were digested and the P3 cells were collected, that is, the purified EnMSCs. The purity of EnMSCs obtained by this method has no difference compared with the traditional method, but the preparation time of the method is shorter, the time of separation is not more than 15min, the component of the separation reagent used in the method is simple and controllable, the operation is convenient, while the preparation cost is reduced, the safety is also improved.

【技术实现步骤摘要】
一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法(一)
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种从月经血中快速高效分离宫内膜间充质干细胞的方法。(二)
技术介绍
干细胞是一类具有自我更新与增殖分化能力的细胞，在细胞和组织修复，以及作为基因治疗的载体等方面有巨大的应用价值。间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)来源广泛、可塑性强，同时拥有易于分离培养、多种因子分泌功能以及免疫调节功能等诸多优点，是目前干细胞领域的研究热点。诸多研究表明MSCs在组织损伤修复和各种疾病治疗方面有良好的应用前景，包括参与骨、软骨和肌腱等组织缺损修复、改善心肌梗死模型的心脏功能、降低急性肺损伤程度、促进糖尿病模型中的葡萄糖调节恢复、降低药物诱导的肝纤维化水平、以及促进神经元再生、皮肤再生和伤口愈合等。研究发现除了骨髓、脐带、脂肪等组织，月经血中也存在丰富的宫内膜来源间充质干细胞(EnMSCs)，由于其体外增殖能力强(可增殖390次，传代50次)，分化潜能大，免疫原性低，生长因子分泌速率高等优点而受到再生医学研究领域的关注。目前EnMSCs分离主要利用淋巴细胞分离液、羟乙基淀粉等除去经血中红细胞，获得有核细胞，并进一步通过贴壁培养方法获得，分离过程耗时较长，所用试剂成分复杂。因此，进一步研究和开发高效的EnMSCs分离技术，缩短分离时间、减少外源引入试剂成分、降低分离成本，对于促进EnMSCs制备的产业化和提高EnMSCs应用安全性具有重要意义。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种从月经血中快速高效分离EnMSCs的方法。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一种从经血中快速高效分离宫内膜间充质干细胞的方法，所述方法为：收集月经血，离心(优选1000rpm离心3min)除去上层血浆，获得沉淀a；向沉淀a中加入溶液Ⅰ，迅速混匀后，静置1-3min，而后加入溶液Ⅱ，混匀后，离心(优选1000rpm离心5min)去上清液，获得沉淀b；将沉淀b用细胞培养液悬浮，于37℃，含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜细胞培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，收集第3代细胞，即为宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)；所述溶液Ⅰ为(1～3)g/L的NaCl水溶液；所述溶液Ⅱ为(15～17)g/L的NaCl水溶液；所述细胞培养液组成为：含体积浓度2％的血清替代物(购自PALL公司)的MEMalpha基础培养液(购自Invitrogen公司)。进一步，所述溶液Ⅰ与溶液Ⅱ体积比为1:1。进一步，所述沉淀b用细胞培养液悬浮后，以2×105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中。进一步，所述溶液Ⅰ与沉淀a的体积比为3～5：1，优选4：1。进一步，所述溶液Ⅰ为2g/L的NaCl水溶液，去离子水配制，高压灭菌，NaCl粉剂可由市购获得。进一步，所述溶液Ⅱ为16g/L的NaCl水溶液，去离子水配制，高压灭菌，NaCl粉剂可由市购获得。本专利技术所述沉淀a和沉淀b均为沉淀，为了区分不同步骤获得的沉淀不同而命名，字母本身没有含义。本专利技术NaCl粉剂可由市购获得。本专利技术所述方法按如下步骤进行：将月经血1000rpm离心3min，去除上层血浆后，获得沉淀a；向沉淀a中加入溶液Ⅰ，充分混匀后，静置1～3min，加入溶液Ⅱ，迅速混匀，而后1000rpm离心5min，去上清液，获得沉淀b；将沉淀b用细胞培养液悬浮，以2*105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，收集P3代细胞，即为宫内膜间充质干细胞。本专利技术EnMSCs通过形态学拍照和流式细胞术进行检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术所述方法采用成分简单明确的NaCl溶液快速有效去除月经血中红细胞，获得有核细胞，经传代培养后获得纯化的EnMSCs。利用本专利技术所述方法所得EnMSCs在纯度方面与传统方法相比无差异，但本专利技术所述方法制备时间更短，分离过程耗时不超过15min，传统方法耗时在30min以上，因而本方法所得细胞活性保持较好，相同代次所得细胞量均明显高于传统方法所得，此外本方法所用分离试剂为NaCl溶液，成分简单可控，操作方便，大大降低了制备成本，并提高了安全性。(四)附图说明图1本专利技术分离获得的EnMSCs形态图。图2传统方法分离获得的EnMSCs形态图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：本专利技术方法分离EnMSCs，包括以下步骤a、试剂配制：溶液Ⅰ：NaCl粉剂可由市购获得，采用去离子水将其溶解，使得浓度为0.2g/100ml，再行高压灭菌。冷却至室温方可使用；溶液Ⅱ：NaCl粉剂可由市购获得，采用去离子水将其溶解，使得浓度为1.6g/100ml，再行高压灭菌。冷却至室温方可使用；b、将20ml月经血1000rpm离心3min，去除上层血浆后，获得细胞沉淀a；向5ml细胞沉淀a中加入20ml溶液Ⅰ，充分混匀后，静置1～3min，加入20ml溶液Ⅱ，迅速混匀，而后1000rpm离心5min，去上清液，获得细胞沉淀b。c、细胞沉淀b用含2％体积浓度血清替代物(购自PALL公司)的MEM-alpha培养基(购自Invitrogen公司)悬浮，同时取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数，最后将有核细胞调整密度后以2*105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，P3代细胞收集鉴定，即为宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)。细胞培养情况见表1。实施例2：传统方法分离EnMSCs，包括以下步骤a、20ml经血1000rpm离心3min，去除上层血浆后，获得细胞沉淀a；向5ml细胞沉淀a中加入10ml生理盐水并充分混匀，获得稀释血样；b、取干净离心管，转移15ml人淋巴细胞分离液(购自达科为生物技术公司)至50ml离心管中；c、铺层加样：将15ml步骤a中的稀释血样加至步骤b中人淋巴细胞分离液的液面上，600g离心20min；提取单个核细胞：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上依次为红细胞粒细胞层、分离液层、单个核细胞层和血浆层；d、小心吸取步骤c中得到的雾状单个核细胞层，并加入生理盐水以1000rpm离心5min，弃上清，获得细胞沉淀。e、步骤d获得的细胞沉淀用含2％体积浓度血清替代物(购自PALL公司)的MEM-alpha培养基(购自Invitrogen公司)悬浮，同时取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数，最后将有核细胞调整密度后以2*105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，P3代细胞收集鉴定，即为宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)。细胞培养情况见表1。表1本专利技术和传统方法所得细胞培养情况实施例3：两种方法所得EnMSCs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于所述方法为：收集月经血，离心除去上层血浆，获得沉淀a；向沉淀a中加入溶液Ⅰ，迅速混匀后，静置1‑3min，而后加入溶液Ⅱ，混匀后，离心去上清液，获得沉淀b；将沉淀b用细胞培养液悬浮，于37℃，含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜细胞培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，收集第3代细胞，即为宫内膜间充质干细胞；所述溶液Ⅰ为1～3g/L的NaCl水溶液；所述溶液Ⅱ为15～17g/L的NaCl水溶液；所述细胞培养液组成为：添加体积浓度2％血清替代物的a‑MEM基础培养基。

【技术特征摘要】
1.一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于所述方法为：收集月经血，离心除去上层血浆，获得沉淀a；向沉淀a中加入溶液Ⅰ，迅速混匀后，静置1-3min，而后加入溶液Ⅱ，混匀后，离心去上清液，获得沉淀b；将沉淀b用细胞培养液悬浮，于37℃，含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜细胞培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，收集第3代细胞，即为宫内膜间充质干细胞；所述溶液Ⅰ为1～3g/L的NaCl水溶液；所述溶液Ⅱ为15～17g/L的NaCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘若浪，杜小春，陈茜，戴玲华，王金福，
申请(专利权)人：杭州易文赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33