PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗及其制备方法，所述疫苗以昆虫作为宿主细胞，转染包含PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的真核表达载体，所述PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述真核表达载体为pAcGP67‑A‑PCV2。所述方法利用分子生物学手段构建含有高免疫原性PCV2ORF2核苷酸序列的重组杆状病毒，所述重组病毒能够在Sf9细胞系中高效表达PCV2衣壳蛋白，并在胞质内组装成具有PCV2表面抗原的PCV2病毒样颗粒。对收获的病毒原液进行过滤系统处理和灭活，辅之以佐剂，制成免疫性高、安全性好的PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗。

PCV2 recombinant baculovirus like particle subunit vaccine and its preparation method

The present invention discloses a PCV2 recombinant baculovirus like subunit vaccine and its preparation method. The vaccine is used as a host cell to transfect the eukaryotic expression vector containing the PCV2 recombinant baculovirus ORF2 gene fragment, and the nucleotide sequence of the PCV2 recombinant baculovirus ORF2 gene fragment, as shown by the SEQ NO.1, ID NO.1. The eukaryotic expression vector is pAcGP67 A PCV2. The proposed method uses molecular biological methods to construct recombinant baculovirus containing high immunogenic PCV2ORF2 nucleotide sequences. The recombinant virus can efficiently express PCV2 capsid protein in the Sf9 cell line and assemble into a PCV2 virus like particle with PCV2 surface antigen in the cytoplasm. PCV2 recombinant baculovirus like subunit vaccine was prepared by filtering and inactivating the harvested virus and supplemented with adjuvant.

【技术实现步骤摘要】
PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗及制备方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，为无包膜的单链环状DNA病毒，是目前发现最小DNA病毒。根据基因组成和病毒抗原性，PCV分为两种血清型，PCV1型和PCV2型。其中PCV1为不致病型，PCV2为致病型。猪圆环病毒病(PCVD)是由PCV2病毒引起的猪传染性疾病，是猪重要的免疫抑制性疾病，该病在猪群中发病严重，已给全球养猪业造成巨大的经济损失。PCV2被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PWMS)的主要病原，它不仅可以导致断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先天性震颤(AII，CT)、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合症(PDNS)和呼吸道疾病综合症(PRDS)密切相关，是全球公认严重危害养猪业的传染病之一。近年来，我国PCV2病毒感染呈上升趋势。PCV2基因组全长1768bp，有11个开放阅读框，ORF1-ORF11。其中ORF1和ORF2为两个主要开放阅读框。ORF1编码与病毒复制相关的酶蛋白，参与病毒复制。ORF2编码病毒的衣壳蛋白，是该病毒的主要免疫原性蛋白。研究表明，在适当条件下，ORF2蛋白可组装成病毒样颗粒(Virus-Like-Particles,VLPs)，VLPs与PCV2病毒粒子具有相似外形，且不含有核酸。免疫动物可诱导产生PCV2病毒中和抗体，是研制基因工程疫苗的重点对象。疫苗预防接种是控制PCV2引起的猪圆环病毒病(PCVD)的最有效手段。目前猪圆环病毒疫苗主要有全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗和弱毒活疫苗。其中国内基本为灭活疫苗。PCV2病毒不易在细胞上增殖，生产病毒滴度低；此外PCV2灭活疫苗还存在着灭活效果难检测，免疫期短，需多次接种免疫，生产成本远高于其他病毒灭活疫苗等问题。弱毒活疫苗则存在着毒力返祖及散毒等潜在危险，且免疫原性差。目前，PCV2亚单位疫苗中的PCV2病毒样颗粒(Virus-Like-Particle,VLP)疫苗是研制基因工程疫苗的重点。VLP疫苗不仅有良好的免疫原性，而且安全性好，可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。大肠杆菌表达系统虽然具有易培养、安全性高等优点，但表达的外源基因蛋白不可溶、且缺乏生物活性和免疫原性。昆虫杆状病毒表达系统在病毒样颗粒(VLP)的构建和应用方面具有明显的优势。昆虫杆状病毒表达系统能够对外源蛋白进行信号肽切除、糖基化等加工修饰；具有强启动子，可加强目的蛋白的转录翻译；可容纳10kb左右的外源基因，并可同时进行多个外源片段的表达；具有明显的宿主界限，对脊椎动物无致病性，安全性高。Merck公司的Circumvent-PCVM和勃林格公司的CircoFlex疫苗均采用昆虫杆状病毒表达PCV2衣壳蛋白，再将其制备成疫苗。该疫苗被证实具有使用剂量少，免疫效果好等优点，对欧洲及北美的PCV2病毒控制发挥了巨大作用。杆状病毒表达系统虽然存在着生产成本低、蛋白表达量高等优点，但由于它对生产工艺、生产技术及生产设备等方面的高要求，限制了该表达系统在我国PCV2疫苗生产上的推广与使用。因此，一种免疫性高、安全性好、可工业化生产的PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗是国内PCV2疫苗生产所需要的。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的问题之一。本专利技术要解决的技术问题之一在于解决国内缺乏高免疫原性PCV2疫苗的问题，为国内提供一种免疫性高、安全性好、可工业化生产的PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗及其制备方法。所述PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗以昆虫作为宿主细胞，转染包含PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的真核表达载体。所述PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述真核表达载体为pAcGP67-A-PCV2，是将PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A载体中的EcoR1/BglII双酶切位点而得到的；所述昆虫为昆虫中的Sf9细胞系。所述方法利用分子生物学手段构建含有高免疫原性PCV2ORF2核苷酸序列的重组杆状病毒，所述重组病毒能够在Sf9细胞系中高效表达PCV2衣壳蛋白，并在胞质内组装成具有PCV2表面抗原的PCV2病毒样颗粒，具体包括如下步骤：(1)采用BDBaculoGold杆状病毒表达系统，将PCV2重组杆状病毒ORF2核苷酸序列通过EcoR1/BglII双酶切连接到pAcGP67-A穿梭载体内，BDBaculoGoldTM线性杆状病毒DNA与pAcGP67-A穿梭载体共转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，筛选高滴度重组杆状病毒作为生产用毒种；(2)采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养，当细胞密度培养至1.5-2×106cells/ml，利用步骤(1)中筛选的高滴度重组杆状病毒进行感染，全悬浮无血清培养5-7天，收获病毒，蛋白生产量可达200～300mg/l，表达蛋白可形成病毒样颗粒；(3)对收获的病毒原液进行过滤系统处理和灭活，辅之以佐剂，制成免疫性高、安全性好的PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗。所述步骤(1)中PCV2ORF2核苷酸序列为GenBankAIT11738.1序列，是PCV2重组杆状病毒ORF2核苷酸序列的质粒pUC57-PCV2根据穿梭载体pAcGP67-A多克隆位点序列，分别在ORF2序列5’端和3’端加入EcoR1和BglII酶切位点；所述PCV2重组杆状病毒ORF2核苷酸全长713bp，具体序列如SEQIDNO.1所示。所述步骤(2)中无血清培养基为EX-CELLTM420无血清培养基；Sf9细胞在细胞生物反应器中的培养条件为：细胞接种量为2-5×105cells/ml，细胞生物反应器转速为80-90rpm，培养温度为26-28℃，溶氧值60％-80％，pH值为6.2-6.5；高滴度重组杆状病毒接种量MOI为1-10，培养温度为26-28℃，pH值为6.2-6.5。进一步的说，所述步骤(2)中表达蛋白为重组杆状病毒表达的PCV2衣壳蛋白，具体氨基酸序列如SeqIDNo.2所示。所述步骤(3)中PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗采用的灭活剂为二乙烯亚胺；灭活步骤为5mM二乙烯亚胺在37℃灭活72小时。进一步的说，所述步骤(3)中PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗抗原佐剂选用5984EP聚合物，终浓度为01.～0.5mg/ml。其中，Sf9细胞，购自美国ATCC；EX-CELLTM420无血清培养基，购自美国Sigma公司。本专利技术还一种真核表达载体，所述真核表达载体为pAcGP67-A-PCV2，是将PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A载体中的EcoR1/BglII双酶切位点而得到的。与现有公开的技术方案相比，本专利技术具有的优势为：1、本专利技术采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统，可利用大型生物反应罐进行全悬浮规模化生产。2、本专利技术中表达生产的抗原蛋白为可溶性蛋白，利用简单的过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗以昆虫作为宿主细胞，转染包含PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的真核表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗以昆虫作为宿主细胞，转染包含PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的真核表达载体。2.根据权利要求1所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1或2所述的一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗，其特征在于，所述真核表达载体为pAcGP67-A-PCV2，是将PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A载体中的EcoR1/BglII双酶切位点而得到的；所述昆虫为昆虫中的Sf9细胞系。4.一种真核表达载体，其特征在于，该真核表达载体为pAcGP67-A-PCV2，是将PCV2重组杆状病毒ORF2基因片段克隆到pAcGP67-A载体中的EcoR1/BglII双酶切位点而得到的。5.一种PCV2重组杆状病毒样颗粒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法利用分子生物学手段构建含有高免疫原性PCV2ORF2核苷酸序列的重组杆状病毒，所述重组病毒能够在Sf9细胞系中高效表达PCV2衣壳蛋白，并在胞质内组装成具有PCV2表面抗原的PCV2病毒样颗粒，具体包括如下步骤：(1)采用BDBaculoGold杆状病毒表达系统，将PCV2重组杆状病毒ORF2核苷酸序列通过EcoR1/BglII双酶切连接到pAcGP67-A穿梭载体内，BDBaculoGoldTM线性杆状病毒DNA与pAcGP67-A穿梭载体共转染Sf9细胞获得重组杆状病毒，筛选高滴度重组杆状病毒作为生产用毒种；(2)采用细胞生物反应器对Sf9细胞进行全悬浮无血清培养，当细胞密度培养至1.5-2×106cells/ml，利用步骤(1)中筛选的高滴度重组杆状病毒进行感染，全悬浮无血清培养5-7天，收获病毒，蛋白生产量可达200～300mg/l，表达蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：任红涛，刘健鹏，邹权，
申请(专利权)人：北京生科基因科技有限公司，榆林市动物疫病预防控制中心，垫江县动物卫生监督所，
类型：发明
国别省市：北京,11