牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。该疫苗组合物包括两种亚型以上牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可以接受的佐剂。制备该疫苗组合物包括以下步骤：1)准备水相和油相，水相和油相的体积比为46:55；2)将水相和油相预热到33℃±1℃；3)先将油相加到容器中，调整好搅拌器的高度和速度，在搅拌的过程中将水相加到油相中，继续搅拌10min～20min；4)将3)步骤乳化好的疫苗组合物置于20℃静置1h；5)将4)中疫苗组合物置于4℃静置24h；6)将5)中的疫苗组合物分装、贴标。该疫苗组合物能够保护不同亚型牛病毒性腹泻病毒的感染，且制备简单、使用量小。

Bovine viral diarrhea virus E2 protein subunit vaccine composition and preparation method and application thereof

The invention discloses a E2 protein subunit vaccine composition for bovine viral diarrhea virus and its preparation method and application, which belongs to the technical field of animal vaccine and veterinary biologics. The vaccine composition comprises two subtypes of bovine viral diarrhea virus E2 protein and pharmaceutically acceptable adjuvants. The preparation of the vaccine consists of the following steps: 1) preparation of water phase and oil phase, the volume ratio of water and oil phase is 46:55; 2) the water phase and oil phase are preheated to 33. 1 C; 3), the oil phase is added to the container, the height and speed of the agitator is adjusted, the water phase is added to the oil phase in the mixing process, and the 10min to 20min is continuously stirred. 4) 3) the emulsified composition of the vaccine was placed at 20 C for 1H; 5) the vaccine composition in 4) was placed at 4 centigrade to static 24h; 6) the vaccine composition in 5) was fitted and labeled. The vaccine composition can protect different subtypes of bovine viral diarrhea virus infection, and is simple in preparation and small in usage.

【技术实现步骤摘要】
牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品

技术介绍
牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea,BVD)又称牛黏膜病(Mucosaldiaease,MD)是由病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV)引起的，临床表现为腹泻、高热、繁殖障碍、免疫抑制、持续性感染和严重的黏膜发炎，糜烂、坏死为特征的疾病。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属。该病最早于1946年发现于美国，后呈爆发式全球流行。在美国、英国、德国、瑞士、澳大利亚、印度、日本等多个养牛大国广泛流行传播。1983年我国首次有报道该病发生，目前在全国已有20多个省、市、自治区存在BVD。2008年，中华人民共和国农业部发布第96号公告，将牛病毒性腹泻定义为三类疫病；世界动物卫生组织也将该病列为法定报告的动物疫病及动物胚胎交流病原名录三类疫病。该病流行范围很广，除牛外，还能感染羊、骆驼、鹿和袋鼠，甚至还有感染人的报道。BVDV主要通过消化道和呼吸道感染动物，既能水平传播也能垂直传播，大多数呈持续性感染(PI)，且免疫抑制容易继发感染黏膜病，死亡率高达100％。这给全世界的养牛业造成了严重的经济损失。BVDV基因组为单股正链RNA，全长约12.5Kb，仅含有一个能编码约4000个氨基酸多聚蛋白的ORF，多聚蛋白经翻译和加工后，可形成11种成熟的蛋白，其中C、Erns、E1、E2是病毒的结构蛋白。E2是BVDV的囊膜蛋白，免疫原性最强，能同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并产生中和抗体，因此是制备检测抗原和疫苗的首选基因。BVDV只有一种血清型，其与猪瘟病毒和羊边界病毒同属黄病毒科瘟病毒属，三者有较高的同源性，血清学有交叉反应。根据基因组5’-UTR、E2等区段的不同，分为BVDV-1型和BVDV-2型。2001年vileek(etal.,Bovineviraldiarrhoeavirusgenotype1canbeseparatedintoatleastelevengeneticgroups.Archivesofvirology,2001.146(1):p.99-115)等根据5’-UTR和Npro(P20)基因的核苷酸序列又将BVDV-1型分为11个亚群，BVDV-1a-1j群和鹿群，其中BVDV-1a和BVDV-1b已经遍布北美和欧洲。我国关于BVDV分子流行病学、基因分析以及系统发育分析的研究相对较少。王新平等将分离得到的毒株归为BVDV-1a亚型和BVDV-1b亚型；任敏从新疆、青海和山东的病料中分离出BVDV-2型病毒。即在我国，存在BVDV-1a亚型、1b亚型和BVDV-2型病毒的感染。但是，目前未见有关一种亚型的牛病毒性腹泻病毒或其E2蛋白能够交叉保护其他分型的病毒感染。且本实验室使用DNAstar软件分析BVDVE2蛋白序列，结果显示，BVDVE2蛋白各亚型之间序列差异较大，同源性不高，详细结果如附图1所示。因此，研究一种能够同时保护不同亚型的牛病毒性腹泻病毒感染的疫苗是目前研究的一个方向和重点。本专利技术提供了一种能够同时保护牛免受不同分型的牛病毒性腹泻病毒感染的亚单位疫苗的组合物。该组合物能够保护牛免受不同分型的牛病毒性腹泻病毒的感染，且该组合物制备简单、使用量小。这对我国乃至世界范围内牛病毒性腹泻病毒的预防控制可以发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是牛病毒性腹泻病毒不同亚型毒株之间的交叉保护差，一种亚型的疫苗不能同时保护牛免受不同亚型毒株的感染本专利技术提供了一种能够同时保护牛免受不同亚型的牛病毒性腹泻病毒感染的亚单位疫苗的组合物。该组合物包括两种亚型以上牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可以接受的佐剂。本专利技术的技术方案中，优选的，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白选自BVDVGS51a型-E2、BVDVJL-11b型-E2和BVDVXJ-042型-E2中的至少一种。本专利技术的技术方案中，优选的，所述组合物还含有免疫增强剂。本专利技术的技术方案中，优选的，所述组合物还含有防腐剂。本专利技术的技术方案中，优选的，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白按照等质量比混合。本专利技术的技术方案中，优选的，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白混合后蛋白总浓度为50μg/头份～200μg/头份。本专利技术的技术方案中，所述免疫增强剂可以为CpGDNA或干扰素等，优选的，免疫增强剂为Quil-A，所述Quil-A的浓度为500μg/头份～750μg/头份。本专利技术的技术方案中，所述防腐剂可以为汞类防腐剂，优选的，所述防腐剂为硫柳汞，所述硫柳汞的含量为每头份疫苗组合物中低于0.01％。本专利技术的技术方案中，所述佐剂可以为水佐剂，如铝胶佐剂等，也可以为油佐剂如白油、ISA206VG等，优选的，所述佐剂为ISA201VG。本专利技术还提供了一种制备该疫苗组合物的方法，包括以下步骤：1)准备水相和油相，水相和油相的体积比为46:55；2)将水相和油相预热到33℃±1℃；3)先将油相加到容器中，调整好搅拌器的高度和速度，在搅拌的过程中将水相加到油相中，继续搅拌10min～20min；4)将3)步骤乳化好的疫苗组合物置于20℃静置1h；5)将4)中疫苗组合物置于4℃静置24h；6)将5)中的疫苗组合物分装、贴标。本专利技术的技术方案中，优选的，所述水相不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白；油相为佐剂ISA201VG。本专利技术的技术方案中，优选的，所述水相还包括免疫增强剂或防腐剂或两者都含有。本专利技术的技术方案中，优选的，所述搅拌速度为350rpm/min～600rpm/min。本专利技术的技术方案中，制备材料和制备过程都是在无菌的条件下进行的。与现有技术相比，本专利技术的组合物能够保护牛免受不同分型的牛病毒性腹泻病毒的感染，且该组合物制备简单、使用量小。这对我国乃至世界范围内牛病毒性腹泻病毒的预防控制可以发挥重要作用。附图说明图1表示DNAstar软件分析我国主要流行BVDV毒株E2蛋白相似性；图2A、图2B、图2C表示免疫后中和实验结果。具体实施方式以下将结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并非限定本专利技术。本专利技术实施例中所使用的菌株、质粒和试剂等均为市售产品。实施例1不同亚型牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的制备参照中国专利技术专利申请公布号为CN105924506A的专利申请文件或者本申请的申请号为201611208261.8的专利技术专利申请文件或者其他蛋白表达方式(如原核表达系统表达)的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的制备方法制备不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白，分别为BVDVGS51a型-E2、BVDVJL-11b型-E2和BVDVXJ-042型-E2。实施例2牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物的制备(以制备2ml/头份，共202ml疫苗组合物为例说明)所用制备疫苗组合物的耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。1、油相(ISA201VG佐剂，购自法国SEPPIC公本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包括两种亚型以上牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可以接受的佐剂。

【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白亚单位疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包括两种亚型以上牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可以接受的佐剂。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白选自BVDVGS51a型-E2、BVDVJL-11b型-E2和BVDVXJ-042型-E2中的至少一种。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白按照等质量比混合。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述不同亚型的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白混合后蛋白总浓度为50μg/头份～200μg/头份。5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述佐剂为ISA201VG。6.根据权利要求1～5任一所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有免疫增强剂、和/或防腐剂。7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述免疫增强剂为Quil-A，所述Quil-A的浓度为500μg/头份～750μg/头份。8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述防腐剂为硫柳汞，所述硫柳汞的含量为每头份疫苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱泓，吴有强，卞广林，张强，查银河，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33