一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗和构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗和构建方法及应用，所述重组的伪狂犬病病毒的基因组含有密码子优化后的猪流行性腹泻病毒S蛋白基因，所述优化后的猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的核苷酸序列A如SEQ NO.1所示。本发明专利技术的重组的伪狂犬病病毒免疫兔子，能够检测出S蛋白的IgG抗体和IgA抗体，不仅能产生IgG抗体而且能产生针对S蛋白的IgA抗体，为研制PRV

【技术实现步骤摘要】
一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗和构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和免疫学领域。具体而言，本专利技术涉及一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗和构建方法及应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是猪的一种高度接触性肠道传染性疾病。临床以呕吐、腹泻和脱水为主要特征。该病对各种年龄阶段的猪均易感，尤其是7日龄以内的哺育仔猪，感染后死亡率可达100％。
[0003]猪流行性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)造成的，该病毒属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)当中的冠状病毒I群成员，具有与冠状病毒科其它成员相似的病毒粒子形态。PEDV基因组核酸类型为线性、单股的正链RNA，全长约28,000nt，5'和3'端分别有帽子结构(cap)和Poly(A)尾。其编码的结构蛋白包括4种：纤突蛋白 (Spike,S)、膜蛋白(Membrane,M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N) 和小膜蛋白(Small membrane,E)。其中，糖基化纤突蛋白S位于PEDV病毒粒子表面，它由S基因编码的1383个氨基酸组成，其分子量约为 180
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220kDa，包含一个信号肽序列、一个跨膜区和一个短的胞内区。作为一种存在于病毒表面的抗原，PEDV的S蛋白在刺激猪机体产生免疫应答方面发挥重要作用。
[0004]PEDV的S蛋白分为两部分：S1(1
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789aa)和S2(790
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1383aa)，其中S1较易变异，存在病毒与受体结合的关键功能区域，S2较为保守。PEDV 感染细胞时，在胰酶作用下，位于囊膜上的S蛋白被水解为S1和S2两个亚单位，S1在与宿主受体结合的同时诱导自身构象发生改变，促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，从而介导病毒进入宿主细胞复制和增殖。S蛋白可以介导PEDV中和抗体的产生，引起机体产生抗PEDV感染免疫。同时， PEDV通过S蛋白识别靶细胞表面的受体，与之结合后，通过膜融合作用侵入宿主细胞内，造成病毒感染。S蛋白还能够影响多个细胞内信号传导过程，抑制宿主细胞的翻译并诱导细胞凋亡。基于S蛋白的上述特性，因此， S蛋白是现有亚单位疫苗、重组载体疫苗等研究的靶点。
[0005]不同PEDV毒株之间S基因序列存在差异，特别是强毒株和弱毒株之间差异更大。韩国毒株(AF500215和AF237764)S蛋白基因比CV777、 Brl/87、JS
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2004
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2、DX、Chinju99等毒株多出10个碱基。DR13亲本毒株和其弱毒株的S基因序列相比存在20个碱基的差异，这20个碱基可能对病毒毒力有重要影响。
[0006]作为猪的一种病毒性传染病，疫苗免疫仍然是预防和控制PED最有效的手段。但PEDV主要造成仔猪腹泻和10日龄仔猪死亡。研究认为，仔猪之所以发生流行性腹泻，一方面是由于PEDV经消化道感染进入猪的肠道，并在小肠绒毛上皮细胞内进行大量增殖，导致细胞崩解、破坏、脱落，从而影响猪肠道对食物的消化及吸收；另一方面由于肠道粘膜上皮细胞内各种酶活性的降低或缺乏，导致肠腔小分子物质(小分子糖、肽等)不能被进一步分解和吸收，再加上母乳中的乳糖和蛋白质不能被及时消化，可引起肠腔内的胶体渗透压升高，而且随着ATP酶活性的降低或缺乏，肠道上皮细胞内钠泵活性丧失，渗透压的升高加剧，这
些因素的叠加导致仔猪发生严重的腹泻、脱水、甚至衰竭死亡。因此，只有提高猪的IgA抗体水平，才能阻断PEDV对仔猪消化道的侵袭。现有的灭活疫苗和亚单位疫苗由于免疫方式的受限，不能产生IgA,因此保护效力有限。而PEDV弱毒疫苗由于毒力反强，易造成安全性等问题。
[0007]为了能提高猪IgA水平，保护仔猪消化道，致弱的活载体成为理想的选择。活载体疫苗是指将病原体的蛋白质编码基因克隆到活病毒载体，然后用于免疫动物，在动物体内表达所述蛋白质，从而诱导针对所述蛋白质的免疫应答。与其他疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。
[0008]伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，具有广泛的宿主范围，可以感染猪、犬、牛、羊等多种家畜和野生动物，但人不易感，在宿主细胞内的增殖能力强，易于扩增，是一种极具开发潜力的疫苗载体，其基因背景清楚，遗传稳定性强；含有许多病毒复制的非必需基因，外源基因容量大(40kb)；重组PRV遗传性状稳定，外源基因不易丢失。除此之外，研究发现，通过皮下注射疱疹病毒，不仅能激发体液免疫，而且还能产生黏膜免疫。Bouma等利用天然弱毒株783株通过皮下免疫猪，诱导了IgA的产生(Immunohistological characterizationof the local cellular response directed against pseudorabies virusin pigs.Veterinary Microbiology 58(1997)145
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154)。Huang等利用致弱的鸭疱疹病毒，通过皮下注射不仅产生了高滴度的IgG而且产生了IgA，并且能够保护鸭子免受1000LD50致死剂量的攻击(An Attenuated DuckPlague Virus(DPV)Vaccine Induces both Systemic and Mucosal ImmuneResponses To Protect Ducks against Virulent DPV Infection.ClinVaccine Immunol.2014Apr；21(4):457
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62)。
[0009]专利虽然CN_107345222构建了重组表达PDEV病毒S1蛋白，该病毒诱导产生了S1蛋白的抗体,但目前S蛋白划分成S1和S2蛋白仅是通过人为的划分，其结构并一定能和S蛋白原有结构一致。且S1蛋白部分易变异，并不能诱导产生针对S蛋白保护性抗体，并且仅提供了体液免疫，没有黏膜免疫，保护不完全。

技术实现思路

[0010]因此，为了解决该问题，本专利技术一方面，基于PEDV S结构设计了针对PEDV结构蛋白S的抗原进行设计；另一方面，为了诱导产生保护性的黏膜免疫，构建一种新的重组病毒，该重组病毒不仅能产生IgG抗体而且能产生针对S蛋白的IgA抗体。这对于猪流行性腹泻病毒预防具有重要的意义。
[0011]有鉴于此，根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种重组伪狂犬病毒，所述重组的伪狂犬病毒的基因组插入有密码子优化后的猪流行性腹泻病毒S蛋白基因，所述优化后的猪流行性腹泻病毒S(PEDV S)蛋白基因的核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组的伪狂犬病病毒，其特征在于，所述重组的伪狂犬病病毒的基因组含有密码子优化后的猪流行性腹泻病毒S蛋白基因，所述优化后的猪流行性腹泻病毒S蛋白基因的核苷酸序列A如SEQ NO.1所示。2.如权利要求1所述的重组的伪狂犬病病毒，其特征在于，所述核苷酸序列A为密码子优化后的猪流行性腹泻病毒来源的糖基化纤突蛋白S或其变体的核苷酸序列，所述变体是糖基化纤突蛋白S氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有糖基化纤突蛋白S的功能。3.如权利要求1所述的重组的伪狂犬病病毒，其特征在于，所述核苷酸序列A与SEQ ID NO:1的同源性≥90％，优选地≥95％，更优选地≥98％。4.如权利要求1
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3任一项所述的重组的伪狂犬病病毒，其特征在于，所述重组的伪狂犬病病毒的基因组包含密码子优化后的猪流行性腹泻病毒来源的糖基化纤突蛋白S或其变体的核苷酸序列的表达框CMV
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A
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bGH，所述表达框CMV
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A
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bGH中，A为密码子优化后的猪流行性腹泻病毒来源的糖基化纤突蛋白S或其变体的核苷酸序列，CMV是CMV启动子，bGH是牛生长激素终止子。5.如权利要求4所述的重组的伪狂犬病病毒，其特征在于，所述密码子优化后的猪流行性腹泻病毒来源的糖基化纤突蛋白S或其变体的核苷酸序列的目标蛋白糖基化纤突蛋白S或其变体的3端加入His标签。6.一种如权利要求1
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5任一所述重组的伪狂犬病病毒的构建方法，其包含如下步骤：(1)将密码子优化后的猪流行性腹泻病毒S基因插入到pEE12.4
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kan上，得到pEE12.4
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S
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kan，其中，所述密码子优化后的猪流...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小晓，钱泓，吴有强，张强，夏青，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：