一种重组的非洲猪瘟病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种重组的非洲猪瘟病毒

【技术实现步骤摘要】
一种重组的非洲猪瘟病毒p72三聚体亚单位蛋白的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于兽用生物制品

。
涉及一种非洲猪瘟
p72
蛋白大规模制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟
(African swine fever
，
ASF)
是可引起的猪的急性
、
热性
、
高度接触性传染病，发病率及死亡率高达
100
％
。
家猪和野猪是
ASFV
自然感染的唯一哺乳动物宿主，对畜牧业影响巨大
。
[0003]国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而自然弱毒苗或重组弱毒苗保护效果好，但安全性差，易造成散毒
。
目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟
。
[0004]非洲猪瘟病毒
(African swine fever virus
，
ASFV)
是具有囊膜的
DNA
病毒
。
病毒粒子平均直径
200nm
，呈二十面体对称结构，表面有含糖脂类的囊膜覆盖
。
其病毒基因组为双股线性
DNA
，大小为
170
‑
190kb
，整个基因组大约有r/>150
个
ORF
，编码
150
‑
200
中蛋白质
。
由外至内分五层结构：分别为外层囊膜结构
、
外层衣壳蛋白
、
内层囊膜结构
、
内层衣壳蛋白，病毒核酸
。P72
蛋白是非洲猪瘟表面外层衣壳最主要结构蛋白
。
其蛋白含量约占病毒粒子蛋白量的
32
％
。
该蛋白由
ASFV
病毒
B646L
基因编码的，分子量大小约
32kD
的蛋白
。
研究发现，
p72
蛋白相对比较保守，有稳定的抗原性
。
且与病毒进入宿主细胞的过程有关，针对
p72
的抗体能够抑制病毒与巨噬细胞的结合
。
因此，
p72
是一个很好的保护性抗原
。
目前，已经有
P72
蛋白能成功的表达在原核系统，但表达产量低，且以包涵体形式存在，
(
具体参见公开号为
CN103805615
的专利技术专利
)
结构折叠不正确，无法满足基因工程亚单位疫苗的开发
。pB602L
蛋白由
B602L
基因编码的病毒非结构蛋白
。
目前的研究发现，该蛋白是病毒复制晚期的一种非结构蛋白，其作为分子伴侣，促进衣壳蛋白
p72
蛋白的正确折叠，若缺少
pB602L
蛋白，会导致衣壳蛋白
p72
不能正确折叠，导致病毒装配过程发生改变不能形成二十面体，最终病毒不能正确组装成病毒颗粒
。
因此，
pB602L
对
p72
蛋白的正确折叠非常关键，因此要想成功大量表达
p72
蛋白必须同时表达
pB602L。Liu
等利用
HEK293
同时表达
p72
和
B602L
得到了三聚体
p72
蛋白，首次展示了
p72
的结构
(Structure of the African swine fever virus major capsid protein p72
，
2019)
，但该方法在
HEK293
中尚不能大量生产，对于后续的开发仍然是个挑战
。
专利
CN111363016A
，文章
(Expression and purification of p72 trimers as subunit vaccine candidate
，
2020)
等公开了一种在酵母中生产重组
P72
的方法，虽然酵母操作相对于真核细胞发酵周期短，成本较低，但该方法生产的
p72
蛋白产量不高
50mg/L,
且
p72
不纯无法去除
B602L。
不利于后续亚单位疫苗评价
。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术的上述技术问题，本专利技术提供一种重组的非洲猪瘟
p72
亚单位蛋白，所述非洲猪瘟病毒
p72
亚单位蛋白主要为三聚体结构的
p72
亚单位蛋白，其中，所述三聚体结构的
p72
亚单位蛋白为非洲猪瘟病毒结构蛋白，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，所述三聚体结构的
p72
亚单位蛋白占总
p72
亚单位蛋白量不低于
75
％
。
本专利技术所述重组的非洲猪瘟
p72
亚单位蛋白的纯度高，几乎不含
B602L
，且基本为三聚体结构
。
[0006]在本专利技术的优选技术方案中，所述三聚体结构的
p72
亚单位蛋白占总
p72
亚单位蛋白含量不低于
80
％
。
[0007]在本专利技术的优选技术方案中，所述三聚体结构的
p72
亚单位蛋白占总
p72
亚单位蛋白量不低于
85
％
。
[0008]在本专利技术的优选技术方案中，所述非洲猪瘟病毒
p72
亚单位蛋白占总蛋白含量不低于
80
％，且
pB602L
亚单位蛋白不高于5％
。
本专利技术还提供一种非洲猪瘟
p72
亚单位蛋白的制备方法，该方法能有效去除
B602L。
[0009]在本专利技术的优选技术方案中，本专利技术提供了一种可在昆虫
‑
杆状病毒表达系统中表达
p72
蛋白的优化后的
OPTI
‑
p72
的核苷酸序列
。
为了能够在昆虫细胞
sf9
或
High Five5
中高效表达
P72
蛋白，本专利技术根据
GenBank:FR6824本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组的非洲猪瘟病毒
p72
三聚体亚单位蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)
重组杆状病毒的制备：将密码子优化后的非洲猪瘟病毒
p72
蛋白和密码子优化后的非洲猪瘟病毒
pB602L
蛋白表达基因经克隆
、
转化
、
感染
sf9
细胞和
/
或
HighFive5
细胞，以得到含有非洲猪瘟病毒
p72
亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒；
2)
发酵培养：再将所述重组杆状病毒进行扩大培养后进行发酵，收集培养液；
3)
亚单位蛋白纯化：发酵培养步骤
2)
中所述培养液进行纯化，纯化后得到重组的非洲猪瘟病毒
p72
亚单位可溶性蛋白；其中，所述非洲猪瘟病毒
p72
蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，所述洲猪瘟病毒
B602L
蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO.6
所示
。2.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤
1)
中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒
p72
蛋白和密码子优化后的非洲猪瘟病毒
pB602L
蛋白表达基因经克隆
、
转化
、
感染
sf9
细胞和
/
或
HighFive5
细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒
p72
蛋白和密码子优化后的非洲猪瘟病毒
pB602L
蛋白表达基因同时克隆到
pFastBac1
转移载体，经克隆
、
转化
、
感染
sf9
细胞和
/
或
HighFive5
细胞，再经发酵培养及纯化，以得到含有非洲猪瘟病毒
p72
亚单位蛋白表达基因的重组杆状病毒
rBac
‑
p72
‑
pB602L。3.
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤
1)
中，所述将密码子优化后的非洲猪瘟病毒
p72
蛋白和密码子优化后的非洲猪瘟病毒
pB602L
蛋白表达基因经克隆
、
转化
、
感染
sf9
细胞和
/
或
High Five5
细胞为将密码子优化后的非洲猪瘟病毒
p72
蛋白和密码子优化后的非洲猪瘟病毒

【专利技术属性】
技术研发人员：张强，钱泓，吴有强，徐玉兰，吴素芳，闻雪，贾宝琴，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：